UPLC-MS/MS法測(cè)定人全血中吲達(dá)帕胺濃度及其生物等效性研究

鄭桂茹，張夢(mèng)琪，張荷麗，陸曉佩，董春霞，曹維鍔

(1.浙江省金華市人民醫(yī)院藥劑科，浙江金華 321000；2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海藥物Ⅰ期臨床暨藥物一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，上海 200031；3.重慶藥友制藥有限責(zé)任公司醫(yī)學(xué)部，重慶 401121；4.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院急診科，上海 200031)

吲達(dá)帕胺是一種噻嗪類利尿劑，對(duì)輕、中度原發(fā)性高血壓效果良好。除了利尿特性外，該藥對(duì)高血壓動(dòng)物模型的靶器官損傷還具有保護(hù)作用，因此在臨床上通常作為大多數(shù)高血壓患者尤其是老年高血壓患者的首選治療藥物。吲達(dá)帕胺口服吸收迅速且完全，生物利用度高達(dá)96%，血漿蛋白結(jié)合率為71%～79%。吲達(dá)帕胺的檢測(cè)方法有LC-MS/MS[1-6]、LC-MS[7]或HPLC-UV[8-10]法，近年來(lái)更多的研究采用了LC-MS/MS法對(duì)血清、血漿、全血等不同基質(zhì)中的吲達(dá)帕胺濃度進(jìn)行檢測(cè)。由于吲達(dá)帕胺與紅細(xì)胞的結(jié)合率高，其全血濃度較血漿濃度、血清濃度更為穩(wěn)定[1]，因此以全血濃度作為一致性評(píng)價(jià)更為恰當(dāng)。本研究參考文獻(xiàn)方法，建立了一種檢測(cè)人全血中吲達(dá)帕胺濃度的UPLC-MS/MS法，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版附錄9012的生物樣品定量分析指導(dǎo)原則[11]進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，對(duì)重慶藥友制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的吲達(dá)帕胺片(2.5 mg/片)與法國(guó)Les Laboratoires Servier公司生產(chǎn)的吲達(dá)帕胺片(2.5 mg/片)進(jìn)行了生物等效性評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 儀器 LC-30超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；Acquity UPLC BEH C18色譜柱、Acquity UPLC柱專用在線過(guò)濾器(美國(guó)Waters公司)；API 4000三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Sciex公司)；BS110S萬(wàn)分之一電子天平、CP225D十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；Mikro 22R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)海蒂詩(shī)公司)；Vortex-2旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)；SB3200超聲儀(上海必能信超聲有限公司)。

1.2 藥品和試劑 吲達(dá)帕胺對(duì)照品(純度98%，美國(guó)藥典委員會(huì)公司，批號(hào)H2M026)；氘3-吲達(dá)帕胺(純度97%，加拿大TRC公司，批號(hào)4-YSW-58-1)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸、甲酸銨(色譜純，美國(guó)CNW公司)；超純水[上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院使用超純水機(jī)(美國(guó)Millpore公司)自制]。

1.3 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：含0.001%甲酸和0.5 mmol/L甲酸銨的水溶液-乙腈(60∶40，V/V)，流速為0.6 ml/min；進(jìn)樣量3 μl；洗針液：甲醇；清洗體積：1 ml；以氘3-吲達(dá)帕胺為內(nèi)標(biāo)。

1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式。離子源電壓為-4500 V，離子源溫度550 ℃；霧化氣壓力413.7 kPa(60 psi)，輔助氣壓力413.7 kPa(60 psi)，氣簾氣壓力172.4 kPa(25 psi)，碰撞氣壓力68.95 kPa(10 psi)。吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)的離子通道分別選擇m/z364.0 →188.9和m/z367.0 →188.9。

1.5 溶液的配制 精密稱量吲達(dá)帕胺對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)適量，溶解于甲醇中，制得吲達(dá)帕胺對(duì)照品儲(chǔ)備液(1×106ng/ml)和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.0×105ng/ml)，4 ℃儲(chǔ)存。取適量吲達(dá)帕胺對(duì)照品儲(chǔ)備液，用含50%甲醇的水溶液稀釋，配制成濃度為30、60、150、300、1200、2400、3000 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和濃度為30、90、450、2250、11 250 ng/ml的質(zhì)控工作液。取適量?jī)?nèi)標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備液，用含50%甲醇的水溶液稀釋，配制成濃度為200 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.6 全血樣品預(yù)處理 取50 μl全血樣品置1.5 ml EP管中，添加5 μl內(nèi)標(biāo)工作液及50 μl含20%甲醇的水溶液，混旋10 s，超聲振蕩30 s，然后添加乙腈200 μl，混旋30 s，放入4 ℃離心機(jī)中以相對(duì)離心力2.515×104×g離心10 min，吸取上清液進(jìn)樣分析。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)譜分析 取吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至1000 ng/ml，按1.4項(xiàng)下質(zhì)譜條件操作。以吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)的[M-H]-峰為母離子，分別進(jìn)行碎片離子掃描。結(jié)果顯示，吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)的主要碎片均為188.9 amu，相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜掃描圖見(jiàn)圖1。

圖1 吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)(氘3-吲達(dá)帕胺)的碎片離子掃描圖Figure 1 Ion scanning mass spectra of indapamide and internal standard (deuterium 3-indapamide)A：吲達(dá)帕胺；B：內(nèi)標(biāo)(氘3-吲達(dá)帕胺)

2.2 特異性考察 選取6份獨(dú)立來(lái)源的空白全血基質(zhì)，除用5 μl含50%甲醇的水溶液代替內(nèi)標(biāo)工作液外，其余步驟按1.6項(xiàng)下全血樣品預(yù)處理的方法操作，之后進(jìn)樣分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間處都沒(méi)有內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。取上述6份獨(dú)立來(lái)源的空白全血基質(zhì)各45 μl，添加吲達(dá)帕胺質(zhì)控工作液5 μl，配制成最低定量限(3 ng/ml)和高濃度(225 ng/ml)的質(zhì)控樣品，每份來(lái)源每個(gè)濃度各3份，按1.6項(xiàng)下全血樣品預(yù)處理的方法操作，然后進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，吲達(dá)帕胺的準(zhǔn)確度為86.52%～103.1%，RSD<2%，表明不同來(lái)源的全血基質(zhì)不影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3 線性范圍的考察 取空白全血45 μl，添加吲達(dá)帕胺標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液5 μl，配制成濃度分別為3、6、15、30、120、240、300 ng/ml的全血標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，按1.6項(xiàng)下全血樣品預(yù)處理的方法操作，然后進(jìn)樣分析。以理論濃度為橫坐標(biāo)(X)，吲達(dá)帕胺與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，經(jīng)“1/X”權(quán)重，進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.030 9X+0.013 2(r=0.999 9)。結(jié)果表明，吲達(dá)帕胺全血樣品在3～300 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性良好，本方法的最低定量濃度為3 ng/ml，信噪比>300。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 取空白全血45 μl，添加吲達(dá)帕胺質(zhì)控工作液5 μl，配制成濃度分別為3、9、45、225、1125 ng/ml的全血質(zhì)控樣品各6份，其中1125 ng/ml的全血質(zhì)控樣品用空白全血稀釋至5倍體積。所有全血質(zhì)控樣品連續(xù)測(cè)定3批，求得準(zhǔn)確度及批內(nèi)、批間精密度。結(jié)果顯示，所有質(zhì)控樣品的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度在93.11%～105.1%，批內(nèi)、批間RSD均<5.76%，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 提取回收率的測(cè)定 測(cè)定低、中、高濃度(9、45、225 ng/ml)的全血質(zhì)控樣品各6份，得到峰面積A1， 同時(shí)取空白全血樣品， 按1.6項(xiàng)下全血樣品預(yù)處理方法操作后，加入適量吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)工作溶液，配制成相當(dāng)于低、中、高濃度的全血質(zhì)控樣品理論進(jìn)樣濃度的溶液各6份，進(jìn)樣分析，得到峰面積A2，以A1/A2的比值計(jì)算吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)的提取回收率。結(jié)果吲達(dá)帕胺低、中、高濃度的提取回收率分別為(92.48±7.72)%、(91.78±6.61)%、(88.66±4.05)%(n=6)，內(nèi)標(biāo)的提取回收率為(91.31±2.46)%(n=18)。

表1 吲達(dá)帕胺含量測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of accuracy and precision tests in content determination of indapamide (%)

2.6 基質(zhì)效應(yīng) 取6個(gè)不同來(lái)源的空白全血各3份，除不添加內(nèi)標(biāo)工作液外，其余步驟按1.6項(xiàng)下全血樣品預(yù)處理方法操作，然后在所得上清液中添加5 μl低、高濃度(90、2250 ng/ml)質(zhì)控工作液和5 μl內(nèi)標(biāo)工作液進(jìn)樣分析，所得峰面積與相同濃度吲達(dá)帕胺和內(nèi)標(biāo)的對(duì)照品溶液峰面積比較，計(jì)算吲達(dá)帕胺、內(nèi)標(biāo)及內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子。結(jié)果顯示，6份不同來(lái)源低、高濃度全血的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子分別為(0.99±0.68)%和(1.00±1.76)%(n=18)，RSD<2%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 考察低、高濃度(9、225 ng/ml)的全血樣品在室溫存放24 h、反復(fù)凍融3次、-20 ℃凍存31 d、-80 ℃凍存59 d、在2～8 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中存放43 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，以上條件下全血樣品中的吲達(dá)帕胺均能保持穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8 生物等效性考察 26例健康受試者空腹口服單劑量2.5 mg吲達(dá)帕胺片受試制劑(規(guī)格：2.5 mg/片，重慶藥友制藥有限責(zé)任公司)與參比制劑(規(guī)格：2.5 mg/片，法國(guó)Les Laboratoires Servier公司，商品名 Natrilix)后，于給藥前(0 h)和給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、12、24、48、72 h采集全血樣本各約3 ml，使用本研究建立的UPLC-MS/MS方法對(duì)全血中吲達(dá)帕胺濃度進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)兩制劑間是否具有生物等效性。該研究經(jīng)上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署了知情同意書(shū)。26例健康受試者空腹口服吲達(dá)帕胺片受試制劑和參比制劑后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。

儲(chǔ)存條件低濃度(9 ng/ml)高濃度(225 ng/ml)室溫放置24 h96.64±3.0296.00±5.64反復(fù)凍融3次92.79±2.8693.91±2.84-20 ℃凍存31 d91.68±5.2792.10±3.57-80 ℃凍存59 d98.98±6.3091.91±4.082～8 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器放置43 h96.91±2.3092.04±5.84

表3 單劑量口服2.5 mg吲達(dá)帕胺片后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)
Table 3 Main pharmacokinetic parameters of indapamide after single oral administration of 2.5 mg indapamide tablets

組別λz(h-1)t1/2(t/h)tmax(t/h)cmax(ρB/ng·ml-1)AUC0～t(A/ng·h·ml-1)AUC0～∞(A/ng·h·ml-1)受試制劑0.05±0.0113.99±1.712.0±0.5114.28±17.381 746.80±297.161 861.97±295.10參比制劑0.05±0.0114.21±1.782.0±1.096.27±13.361 717.94±277.491 835.28±265.85

圖3 受試者單劑量口服2.5 mg吲達(dá)帕胺片后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Figure 3 Mean plasma concentration-time curves of indapamide after single oral administration of 2.5 mg indapamide tablets

3 討 論

吲達(dá)帕胺在ESI正、負(fù)模式下均能產(chǎn)生分子離子峰，且MRM信號(hào)強(qiáng)度相似，文獻(xiàn)報(bào)道也有不同的選擇[1-7]；考慮到一般情況下負(fù)離子模式的干擾更小，本研究采用了負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。在流動(dòng)相的選擇方面，本研究以甲酸為添加劑獲得了良好的色譜峰型；同時(shí)，為了避免甲酸對(duì)負(fù)離子模式下吲達(dá)帕胺電離的抑制，僅添加了0.001%的甲酸，以此兼顧了良好的色譜行為及靈敏度。另外，本研究建立的方法存在顯著的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)的存在使吲達(dá)帕胺及內(nèi)標(biāo)的絕對(duì)響應(yīng)提高了70%以上，而由于內(nèi)標(biāo)是吲達(dá)帕胺的穩(wěn)定同位素，其與吲達(dá)帕胺跟隨性良好，內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子在0.977～1.030范圍內(nèi)，RSD<2%，因此基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)并不影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

本研究使用乙腈對(duì)全血樣品進(jìn)行蛋白沉淀，用UPLC-MS/MS法測(cè)定吲達(dá)帕胺濃度，方法操作簡(jiǎn)便，僅需50 μl全血樣品，定量下限為3 ng/ml，分析時(shí)間為1.5 min，方法靈敏、準(zhǔn)確、通量高、穩(wěn)定性好，各項(xiàng)方法學(xué)參數(shù)完全滿足《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版附錄9012：生物樣品定量分析指導(dǎo)原則[12]的規(guī)定，適用于吲達(dá)帕胺的臨床藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究。