基于宏基因組學(xué)分析不同貯藏溫度下生食章魚制品的菌相變化

薛 靜 戴志遠(yuǎn)* 李 科 馬繼民 王洪川

（1 浙江工商大學(xué) 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012 3 浙江新天久海產(chǎn)有限公司 浙江舟山316000）

蛸類屬軟體動物門（Phylum Mollusca），頭足綱（Class Cephalopoda），八 腕 目（Order Octopoda），蛸科（Octopodidae），又稱章魚[1]，是高蛋白、低脂肪、 富含多種營養(yǎng)成分且具有一定藥用價(jià)值的海產(chǎn)佳品。 章魚大多以初級加工品形式進(jìn)入國內(nèi)外市場，附加值較低。 以章魚預(yù)調(diào)理食品、生食章魚制品等為代表的章魚精加工產(chǎn)品， 不僅食用方法簡單， 而且具有獨(dú)特的食用風(fēng)味和較高的食用價(jià)值，國內(nèi)外市場廣闊。 然而，為保證生食章魚制品生食風(fēng)味，未采用熱加工處理，故而產(chǎn)品初始菌相復(fù)雜，耐貯藏性較差。以上問題成為了生食章魚制品在保障市場流通以及質(zhì)量安全中的巨大隱患。

目前， 國內(nèi)外學(xué)者對章魚的研究主要集中于生態(tài)習(xí)性與養(yǎng)殖、營養(yǎng)成分分析、遺傳多樣性、免疫機(jī)制、生物活性物質(zhì)開發(fā)利用等研究方面[2-5]，對于生食水產(chǎn)品的研究多集中在致病菌的監(jiān)測、風(fēng)險(xiǎn)評估和分析上[6-7]，而有關(guān)即食生食水產(chǎn)品，尤其是生食章魚制品這一類新產(chǎn)品貯藏期菌相變化的研究尚未見報(bào)道。 宏基因組學(xué)作為新興的微生物分析手段， 克服了基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物檢測方法的弊端，能夠更全面、客觀地反映樣品中微生物的組成。該方法已成為研究環(huán)境微生物群落豐度、多樣性變化最有效的方法之一， 廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[8-9]、環(huán)境[10]、農(nóng)學(xué)[11]等領(lǐng)域，而在食品科學(xué)領(lǐng)域主要集中于傳統(tǒng)發(fā)酵食品[12-14]。參考實(shí)際生活中食品的貯藏溫度，選定25，15，5，-5 ℃為溫度梯度開展研究。在前期研究基礎(chǔ)上，分別研究不同貯藏溫度下生食章魚制品產(chǎn)品菌相變化， 確定不同溫度下生食章魚制品中的優(yōu)勢菌， 旨在為章魚貯藏保鮮提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

1.1.1 樣品加工 章魚原料由浙江新天久海產(chǎn)有限公司提供， 用碎冰包裹并于4 h 內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。樣品加工流程如下：章魚原料→鹽滾（去泥沙、黏液）→冰水漂洗、降溫→去頭、嘴、內(nèi)臟等廢棄物→冰水降溫→切段→鹽漬→脫鹽、 瀝水→糖浸→投料（復(fù)合調(diào)味料）→拌料→裝袋→入庫。

其中：復(fù)合調(diào)味料以天然植物調(diào)味料，如姜、蒜、辣椒、紫蘇等，以及鹽、糖、味精等調(diào)味品按不同比例調(diào)配而成。

1.1.2 樣品采集 上述樣品于無菌條件下分裝至無菌食品級包裝袋中， 并分別置于25，15，5 和-5℃條件下恒溫貯藏。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果確定取樣時(shí)間分別為：初始樣品（zyl）為生食章魚制品第0 天直接留樣；-5 ℃樣品（ypf5）取樣時(shí)間為第90 天；5 ℃貯藏中期（zq5）為第40 天，貯藏末期（mq5）為第80 天；15 ℃樣品貯藏中期（zq15d）為第8 天，貯藏末期（mq15）為第16 天；25 ℃樣品貯藏中期（zq25）為第3 天，貯藏末期（mq25）為第6天。

1.2 儀器設(shè)備與材料

1.2.1 儀器設(shè)備 Fresco21 微量離心機(jī)， 美國Thermo 公司；凝膠電泳儀，美國BIO-RAD 公司；Wide Mini-SubRCell GT 水平電泳槽， 美國BIORAD 公 司；Mili-Q 超純水機(jī)Gradient 型， 美 國GRANT 公司；RC-6 Plus 高速冷凍離心機(jī)， 美國Thermo 公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器， 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-150-S 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠。

1.2.2 試驗(yàn)材料 限制性內(nèi)切酶，寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA 聚合酶，TakaRa 寶成試劑有限公司；1 000 bp Marker，TakaRa 寶成試劑有限公司； 瓊脂糖凝膠（分析純）， 西班牙進(jìn)口分裝；EDTA（分析純），無錫市展望化工試劑有限公司；RNA 酶A，美國Sigma 公司；細(xì)菌基因組DNA 小量提取試劑盒， 北京莊盟國際生物基因科技有限公司；異丙醇（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；溴化乙啶（分析純），美國Sigma 公司。

1.3 細(xì)菌DNA 的提取

參考ERMA D[15]的方法，稱取樣品5.0 g 置于無菌錐形瓶中，加入50 mL 無菌生理鹽水，37 ℃恒溫?fù)u床振搖15 min （200 r/min）。 4 層無菌紗布過濾，收集濾液，離心（1 000 r/min，6 min，4 ℃），取上清液，再次離心（8 500 r/min，5 min，4 ℃），取沉淀。使用細(xì)菌基因組DNA 小量提取試劑盒對上述步驟中的沉淀進(jìn)行處理，收集溶液，于-30 ℃條件下保存。 產(chǎn)物首先采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度及純度檢測。 根據(jù)濃度檢測結(jié)果，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 樣品的完整性（電壓120 V，電泳時(shí)間20 min）。

1.4 16S rDNA V4 區(qū)的PCR 擴(kuò)增及Illumina 測序

PCR 擴(kuò)增引物為520F：（5-AYTGGGYDTAAAGNG-3）和802R：（5-TACN VGGGTATCTAATCC-3）。

25 μL 反應(yīng)體系為：8.75 μL 滅菌超純水，5.0 μL Q5 Reaction Buffer（5×），5.0 μL Q5 GC high Enhancer（5×），2.0 μL dNTP（2.5mmol/L），2.0 μL模板（原液），1.0 μL 引物F（10μmol/L），1.0 μL 引物R （10μmol/L），0.25 μL Q5 Polymerase （5U/μL）。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測， 并回收， 進(jìn)行Illumina 雙末端測序，并以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行Illumina Mi-Seq 測序文庫制備。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

1.5.1 原始雙端序列的過濾和連接 采用Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行測序， 參考結(jié)合ERMA D[16]、Magoc T[17]、Caporaso JG[18]等的方法，適當(dāng)改動，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾、篩選獲取有效序列。

1.5.2 優(yōu)質(zhì)序列的獲取 運(yùn)用Qiime 進(jìn)行序列過濾，去除5’端引物錯(cuò)配堿基數(shù)>1 的序列，去除含有模糊堿基的序列； 去除含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列，去除長度≤150 bp 的序列；去除嵌合體序列，得到優(yōu)質(zhì)序列，用于后續(xù)分析。

1.5.3 OTU 聚類 在Qiime 軟件中調(diào)用uclust 的方法對優(yōu)質(zhì)序列按序列相似度0.97 進(jìn)行聚類，選取每個(gè)類中最長的序列為代表序列， 并對序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得每個(gè)OTU 代表序列的分類學(xué)信息，生成不同分類水平上（門、綱、目、科、屬）的物種豐度表和多樣品物種分布圖。

1.5.4 多樣性分析 使用mothur 軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析（Chao 指數(shù)、Shannon 指數(shù)）。

1.5.5 聚類分析 應(yīng)用軟件R（pheatmap）將屬水平上分類信息進(jìn)行聚類并繪制熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 生食章魚細(xì)菌總基因組DNA 提取結(jié)果

生食章魚細(xì)菌總基因組DNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖1 所示。由圖可知，提取到的基因組DNA 均較完整，提取結(jié)果較好，但7、8 號DNA 條帶較暗， 可能是檢測時(shí)使用的DNA 濃度過低，但不影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。

圖1 樣品總基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The extracted genomic DNA of different samples

2.2 生食章魚細(xì)菌16s rDNA V4 可變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

以上步驟提取到的樣品細(xì)菌總基因組DNA為模板， 根據(jù)試驗(yàn)方法中的PCR 反應(yīng)體系和程序， 對細(xì)菌16S rDNA 的V4 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果如圖2 所示。 根據(jù)膠圖檢測結(jié)果可知，8 組樣品均可擴(kuò)增出目的條帶，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 樣品16S rDNA V4 可變區(qū)段PCR 擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophorelogram of PCR amplicons of 16S rDNA V4 region of different samples

2.3 測序基本數(shù)據(jù)處理結(jié)果

8 個(gè)樣品經(jīng)DNA 測序后， 共獲得16S rDNA V4 區(qū)的有效序列254 716 條， 其中樣品的最大序列數(shù)為71 317 條，最小序列數(shù)為27 947 條，每個(gè)樣品平均序列數(shù)為31 840 條。 質(zhì)控后序列長度大部分分布在220～230 之間， 優(yōu)質(zhì)序列占有效序列的比例平均為96.6%，達(dá)到基本分析要求，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。

2.4 OTU 聚類結(jié)果

OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類單元）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于分析， 人為給某一個(gè)分類單元設(shè)置的同一標(biāo)志[19]，通常在97%的相似水平下對序列進(jìn)行OTU的聚類和后續(xù)的生物信息分析。原始OTU 列表去掉豐度值小于總序列條數(shù)0.001%的OTU 后的聚類結(jié)果如表1 所示。

2.5 Alpha 多樣性分析

圖3 優(yōu)質(zhì)序列長度分布圖Fig.3 Length distribution of high quality sequence

Alpha 多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量指數(shù)有：群落豐富度指數(shù)及群落多樣性指數(shù)。Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)[20]，指數(shù)越大，說明群落豐富度越高。 而豐富度指數(shù)存在忽略富集種和稀疏種對群落多樣性貢獻(xiàn)不同的問題， 因而需要結(jié)合均勻度指數(shù)才能更客觀地反映群落的多樣性水平。 Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)[21]均可用來估算樣品中微生物多樣性，Shannon 指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。 不同貯藏溫度下生食章魚的生物多樣性指數(shù)見表2。

表1 OTU 聚類結(jié)果Table 1 Statistical analysis of OTU

表2 生食章魚制品Alpha 多樣性指數(shù)表Table 2 Alpha diversity metrics of instant octopus products

由表可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，生食章魚制品中的物種豐富度和均勻度發(fā)生著較大的變化，且不同溫度下貯藏的樣品之間存在著明顯差異。-5 ℃組的Chao1 指數(shù)均小于初始樣品組，Shannon指數(shù)差別不大，說明在-5 ℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，樣品中物種數(shù)量逐漸減小，多樣性變化不明顯。 在5 ℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，樣品中物種數(shù)量增多，物種豐富度逐步增加；貯藏前期，細(xì)菌迅速繁殖，物種均勻度上升，多樣性變高，貯藏后期，部分細(xì)菌快速成長為優(yōu)勢菌，物種均勻度下降，多樣性降低。15 ℃組隨著貯藏時(shí)間的延長，樣品中物種數(shù)量先下降后上升，但至貯藏末期，物種豐富度仍不及初始樣品，隨著酸性物質(zhì)的不斷累積，微生物的抑制作用越發(fā)強(qiáng)烈，物種均勻度下降，多樣性明顯降低。25 ℃組隨著貯藏時(shí)間的延長，樣品中所含物種數(shù)量直線下降，豐富度迅速減小，優(yōu)勢菌優(yōu)勢凸顯，物種均勻度變差，多樣性大幅下降。

2.6 基于群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)OTU 表的結(jié)果，可以得到各個(gè)樣品內(nèi)微生物在各分類水平（門、綱、目、科、屬）上的物種組成比例情況， 反映樣品在不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)。

2.6.1 樣品微生物門水平組成分析 不同溫度下貯藏的生食章魚微生物于門水平上的群落分布如圖4 所示。

由圖可知， 初始樣品組優(yōu)勢微生物為變形菌門（Proteobacteria，67.1%），此外還包括厚壁菌門（Firmicutes，14.13%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，8.89%）、螺旋菌門（Spirochaetae，1.69%）和放線菌門（Actinobacteria，1.31%）。 -5 ℃條件下貯藏的樣品物種組成與初始樣品基本相同， 但比例稍有變化。

隨著貯藏時(shí)間的延長，5，15 和25 ℃溫度下貯藏的生食章魚內(nèi)部菌相發(fā)生顯著變化。5 ℃條件下貯藏的樣品，至貯藏中期變形菌門（62.21%）仍為優(yōu)勢微生物，但比例有所下降，而厚壁菌門（14.13%）、擬桿菌門（16.39%）和放線菌門（14.10%）比例均有所上升；隨著貯藏時(shí)間的延長，厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門的比例明顯增大， 變形菌門的比例明顯下降，至貯藏末期厚壁菌門（40.15%）已迅速成長為優(yōu)勢微生物。15 ℃條件下貯藏的樣品與25℃樣品類似，隨著貯藏時(shí)間的延長，變形菌門的比例急劇下降， 至貯藏中期厚壁菌門已迅速成長為優(yōu)勢微生物，至貯藏末期，厚壁菌門的比例已分別達(dá)到92.29%和84.81%。

2.6.2 樣品微生物屬水平組成分析 為了進(jìn)一步分析貯藏溫度對生食章魚微生物的影響， 深入地分析不同貯藏溫度下生食章魚微生物在屬水平上的組成和數(shù)量的變化情況， 如圖5 所示。 由圖可知， 初始樣品組的優(yōu)勢微生物為腸桿菌屬（Enterobacter，31.30%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，17.0%）。

-5 ℃條件下貯藏的生食章魚在屬水平上的組成與初始樣品組基本相同，僅各屬比例稍有變化，其中革蘭氏陰性菌占優(yōu)勢。 優(yōu)勢微生物仍為腸桿菌屬（Enterobacter，31.37%）， 此外， 假單胞菌屬（Pseudomonas）和脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）比例有所下降，而明串珠菌屬（Leuconostoc）、動性微菌屬（Planomicrobium）、魏斯氏菌屬（Weissella）和不動桿菌屬（Acinetobacter）比例均有所上升。腸桿菌廣泛分布在新鮮或者加工過的水產(chǎn)品中， 而假單胞菌屬為嗜冷菌種，一般在-15～20 ℃之間最適宜生長，廣泛存在于海水、淡水和土壤中，是水產(chǎn)品低溫貯藏過程中的主要腐敗菌之一。 在該貯藏條件下，樣品中的產(chǎn)酸菌不僅比例較低，數(shù)量也較其它溫度少。 假單胞菌屬是一種常見的水產(chǎn)品腐敗菌，會產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，比如醛、酮、酯和硫化物，會散發(fā)出特有的濃郁氨臭味[22-23]。

圖4 各樣本于門水平上的菌群分布Fig.4 Microflora distribution of different samples at phylum level

5，15 和25 ℃條件下貯藏的生食章魚在屬水平上的組成發(fā)生著顯著變化。 5 ℃條件下，革蘭氏陰性菌的優(yōu)勢地位下降， 樣品中的葡萄球菌屬在經(jīng)過一段時(shí)間的緩慢增加后， 自中期開始迅速成長為優(yōu)勢微生物，至末期達(dá)到33.24%；貯藏期內(nèi)，黃桿菌屬呈直線上升趨勢；假單胞菌屬、脫硫葉菌屬呈先緩慢上升后迅速下降的趨勢；腸桿菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬呈直線下降趨勢。 15 ℃條件下，革蘭氏陽性菌占絕對優(yōu)勢，樣品中的葡萄球菌屬呈直線上升趨勢， 于貯藏中期即成長為優(yōu)勢微生物，至貯藏末期達(dá)到81.22%；此外，貯藏期內(nèi)魏斯氏菌屬呈現(xiàn)緩慢下降后快速上升趨勢， 至貯藏后期達(dá)到10.18%；腸桿菌屬、假單胞菌屬、明串珠菌屬和脫硫葉菌屬的比例呈直線下降趨勢。 葡萄球菌屬為革蘭氏陽性菌，多數(shù)為非致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，能夠產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，降解氨基酸和脂肪酸，并具有過氧化氫活性，多數(shù)能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖產(chǎn)酸。

25 ℃條件下，革蘭氏陽性菌占絕對優(yōu)勢，樣品中的魏斯氏菌屬于貯藏中期即迅速成長為優(yōu)勢微生物，并于貯藏末期達(dá)到73.58%；此外，隨著貯藏時(shí)間的延長，葡萄球菌屬的比例持續(xù)增加，至貯藏末期達(dá)到10.08%；腸桿菌屬、假單胞菌屬、明串珠菌屬和脫硫葉菌屬的比例呈直線下降趨勢。

圖5 各樣本在屬水平上菌群分布Fig.5 Microflora distribution of different samples at genus level

魏斯氏菌屬于乳酸細(xì)菌（LAB），為革蘭氏陽性菌，可代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸、二氧化碳、乙醇或（和）乙酸，最適生長溫度為15～45 ℃，其生存環(huán)境比較廣泛，植物型材料、肉類制品以及人和動物的糞便中均可分離得到[24-26]。 研究表明，乳酸菌可以通過抑制生長和產(chǎn)生抑菌代謝產(chǎn)物方式來阻遏其它菌的生長， 這類代謝產(chǎn)物包括有機(jī)酸， 細(xì)菌素等。 普通細(xì)菌的生長最適pH 值在6～7 之間，若低于該值， 細(xì)菌的生長速率將大大降低或不生長甚至死亡。

2.6.3 聚類分析 將不同溫度貯藏的生食章魚樣品微生物在屬水平上的分類信息進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖6 所示。由聚類分析的結(jié)果可知：25 ℃中期樣品、5 ℃末期樣品、25 ℃末期樣品和15 ℃末期樣品4 個(gè)樣品聚為一類，-5 ℃樣品、 初始樣品、15℃中期樣品3 個(gè)樣品聚為一類，5 ℃中期樣品聚為一類。隨著貯藏溫度的升高和貯藏時(shí)間的延長，初期、 中期和末期微生物種群和數(shù)量發(fā)生了明顯的變化； 降低貯藏溫度對于保持生食章魚的初始菌相具有較好的作用。

圖6 樣品聚類分析Fig.6 Cluster pedigree diagram of samples

3 結(jié)論與展望

本文結(jié)合宏基因組學(xué)， 利用高通量測序技術(shù)對不同貯藏溫度下的生食章魚制品貯藏期內(nèi)的菌相變化進(jìn)行了分析。 主要結(jié)論如下：（1）隨著貯藏溫度的升高和貯藏時(shí)間的延長， 菌相越發(fā)趨于單一，與初始樣品差別越大，樣品中的優(yōu)勢菌由革蘭氏陰性菌逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦锾m氏陽性菌；（2）不同溫度貯藏下的生食章魚在門水平上的群落分布主要為變形菌門，厚壁菌門和擬桿菌門，隨著貯藏溫度的升高和貯藏時(shí)間的延長， 變形菌門的比例逐漸下降，厚壁菌門的比例逐漸上升；（3）25，15，5 ℃條件下貯藏的生食章魚的優(yōu)勢菌分別為魏斯氏菌屬，葡萄球菌屬，葡萄球菌屬；-5 ℃條件下貯藏的樣品至貯藏期 （90 d）末與初始樣品菌相之間差異不大，優(yōu)勢菌仍為腸桿菌屬。 （4）降低貯藏溫度對于保持生食章魚的初始菌相具有較好的作用， 于-5℃條件下貯藏可延緩產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，延長貨架期。

本研究深入分析了生食章魚制品貯藏期間的菌相變化，確立了不同貯藏溫度下的優(yōu)勢菌種類，為今后進(jìn)一步優(yōu)化該類產(chǎn)品加工工藝和貯藏方法， 建立相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制體系等提供了一定的參考依據(jù)。