采后硝普鈉處理對生姜根莖能量代謝的影響

李燦嬰 魏美林 葛永紅 陳延儒 楊軼為 勵建榮

（渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心 遼寧錦州121013）

生姜，別名白姜，是多年生單子葉草本植物姜科姜屬（Zingiber officinale Roscoe）姜的新鮮根莖[1]， 是我國首批公布的藥食兩用植物資源之一。新鮮生姜根莖肉質肥厚，具特殊的香辛味，不僅富含碳水化合物、蛋白質、膳食纖維、姜油酮、姜酚和姜精油等營養(yǎng)成分，而且在降血脂、抗氧化和抗衰老等方面具有顯著的功效[2]。生姜雖是一種非呼吸躍變型蔬菜，但剛采收的生姜表皮易脫落，根莖易失水老化，呼吸代謝旺盛，營養(yǎng)成分損失率高，導致根莖品質變劣，經濟價值和食用品質降低[3]。 已有研究報道， 果實的衰老與線粒體能量代謝密切相關，并且能量虧缺會導致線粒體功能下降，從而削弱生物體對逆境的適應能力， 導致生理紊亂和病害發(fā)生[4-7]。

硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）作為外源NO 供體，進入細胞后會在一定時間內通過還原反應自發(fā)分解并釋放NO[8]。有研究表明，SNP 能夠保持香蕉[9]、枇杷[10]、枸杞[11]、蓮霧[12]、茄子[13]和芒果[14]等果蔬采后品質，延遲番茄乙烯生成[15]，提高桃[16]和香蕉[17]等果實采后抗冷能力。 外源SNP 對生姜根莖采后貯藏過程中線粒體能量代謝與根莖衰老的影響尚未見研究報道。

本文以生姜根莖為試材， 采后用SNP 溶液浸泡處理， 研究常溫貯藏過程中線粒體能量代謝相關 酶H+-ATPase、Ca2+-ATPase、 琥珀酸脫氫酶（SDH）、細胞色素氧化酶（CCO）活性及ATP、ADP、AMP 含量和能荷的變化，以期揭示常溫貯藏過程中生姜根莖線粒體能量代謝與衰老的關系， 為闡明生姜根莖衰老的機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試生姜根莖， 采自遼寧省北鎮(zhèn)市露地栽培大田， 愈傷后的生姜紙箱包裝運抵實驗室常溫放置。選取適宜成熟度，無病蟲害，無機械損傷，大小和色澤基本一致的生姜待用。

硝普鈉（SNP）（分析純），西亞試劑；5′-三磷酸腺苷鈉鹽（ATP）、5′-二磷酸腺苷鈉鹽（ADP）、5′-單磷酸腺苷鈉鹽（AMP），Sigma-Aldrich 公司；2，6-二氯酚靛鈉 （DCPIP），Sigma-Aldrich 公司； 乙腈（色譜純），美國天地公司；無機磷試劑盒，南京建成生物工程研究所；琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒，南京建成生物工程研究所； 其它化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-2550 型分光光度計，日本島津公司；H-1650R 型離心機，長沙湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 處理方法 采收的生姜用清水洗凈表面的泥土后平攤在實驗臺上室溫靜置晾干。 將姜塊隨機分成2 組，室溫下分別用去離子水（對照）和0.25 mmol/L 的SNP（前期預實驗篩選）溶液（含0.05% Tween-20）浸泡10 min，取出自然晾干，裝入塑料籃后放置在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（20 ℃±1 ℃，RH 90%～95%）待用，每處理210 塊生姜根莖。

1.3.2 取樣方法 SNP 處理組和對照組生姜根莖分別于處理后0，3，6，9，12，15，18 d， 取皮下1～5 mm 處根莖組織，混合后切碎，錫箔紙包裹，經液氮冷凍后放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 指標測定

1）線粒體的提取 參照文獻[18]的方法并修改。 取25 g 冷凍組織用液氮研磨成粉， 加入10 mL 含0.25 mmol/L 蔗 糖、0.3 mol/L 甘 露 醇、1.0 mmol/L EDTA、 質量分數分別為0.1% BSA、0.5%PVP、0.1%半胱氨酸的50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，繼續(xù)研磨成勻漿。濾液在4 ℃、4 000×g 條件下離心10 min。 取上清液在4 ℃，14 000×g條件下離心20 min， 將沉淀用10 mL 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl pH 7.2， 內含0.25 mol/L 蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1% BSA）洗滌，4 ℃、14 000×g 條件下離心20 min，再取上清液離心分離，得到的沉淀即為線粒體，加入1.5 mL懸浮液 （10 mmol/L pH 7.2 Tris-HCl， 內含0.25 mol/L 蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1.0 mmol/L EDTA）懸浮，即為線粒體制備液。

2）H+-ATPase 活性測定 參照文獻[18]的方法， 用南京建成生物工程研究所生產的H+-ATPase 試劑盒測定反應釋放的無機磷含量。 以每小時每毫克蛋白的ATP 酶分解ATP 產生1 μmol 無機磷的量表示H+-ATPase 活性， 表示為U/mg 蛋白。

3）Ca2+-ATPase 活性測定 參照文獻[18]的方法， 用南京建成生物工程研究所生產的Ca2+-ATPase 試劑盒測定反應釋放的無機磷含量。 以每小時每毫克蛋白的ATP 酶分解ATP 產生1 μmol無機磷的量表示Ca2+-ATPase 活性， 表示為U/mg蛋白。

4）琥珀酸脫氫酶 （succinate dehydrogenase，SDH）活性測定 使用南京建成生物工程研究所生產的琥珀酸脫氫酶測試盒測定。 以每毫克蛋白每分鐘使反應體系吸光度降低0.01 為1 個比活性單位，表示為U/mg 蛋白。

5）細胞色素氧化酶 （cytochrome oxidase，CCO）活性測定 參照文獻[18]的方法。 取線粒體制備液0.1 mL， 加入質量分數為0.04%的細胞色素C 水溶液0.2 mL，重蒸水2 mL。 將試樣在37 ℃預熱2 min，加入0.5 mL，質量分數為0.4%的二甲基對苯二胺溶液，保溫3 min 至出現紅色，顏色在10 min 內穩(wěn)定，于510 nm 比色，以每毫克蛋白每分鐘吸光值變化0.1 為1 個活性單位， 結果以U/mg 蛋白表示。

6）ATP、ADP 和AMP 含量測定 參照文獻[19]的方法。 采用HPLC 法測定ATP、ADP 和AMP的含量，色譜條件為C18色譜柱（ODS，250 mm×4.6 mm），檢測波長為254 nm，流動相為乙腈（A）和磷酸鉀緩沖液（B）（0.04 mol/L KH2PO4和0.06 mol/L K2HPO4混合液，pH 7.0，0.45 μm 濾膜過濾）。 線性梯度洗脫，時間7 min，延遲3 min，流速為1.2 mL/min，流動相A 的體積分數為75%～100%，流動相B 的體積分數為0～25%，進樣體積為20 μL。 標準樣品ATP、ADP 和AMP 購自Sigma 公司，配制0～200 mg/mL 的混合溶液制作標準曲線。

能荷 （EC）計算公式：EC=（[ATP] + 0.5×[ADP]）/（[ATP] + [ADP] + [AMP]）。

1.4 數據分析

所有指標測定進行3 次生物學重復， 數據處理采用SPSS 19.0 進行Ducan’s 多重比較分析（P<0.05），采用Microsoft excel 作圖。

2 結果與分析

2.1 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體H+-ATPase 活性的影響

H+-ATPase 是植物中的一種ATPase 質子泵。一對ATP 水解出質子轉運出細胞，從而形成一個電化學質子通道用于營養(yǎng)物質的轉運[17]。 由圖1可知， 采后生姜根莖H+-ATPase 活性隨貯藏時間延長逐漸降低， 但SNP 處理組生姜根莖H+-ATPase 活性在整個貯藏期間均高于對照組， 說明SNP 處理能很好的維持生姜根莖的H+-ATPase 活性。 在常溫貯藏第9 天時，H+-ATPase 活性為對照組的1.33 倍； 在貯藏第18 天時，SNP 處理組H+-ATPase 活性為對照組的1.41 倍。

2.2 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體Ca2+-ATPase 活性的影響

Ca2+-ATPase 是激發(fā)ATP 水解的初級鈣離子轉運蛋白。 Ca2+-ATPase 能保持鈣穩(wěn)態(tài)，從而延緩衰老[20]。線粒體H+-ATPase 和Ca2+-ATPase 活性對保持線粒體結構穩(wěn)定和維持正常呼吸代謝具有重要作用。 由圖2 可知， 整個貯藏過程中生姜根莖Ca2+-ATPase 活性總體呈下降趨勢，SNP 處理顯著（P＜0.05）提高了生姜根莖Ca2+-ATPase 活性。在第3 天時，SNP 處理的生姜根莖Ca2+-ATPase 活性最高， 是對照組的1.81 倍。 對照組生姜根莖Ca2+-ATPase 活性始終呈緩慢下降趨勢。 在貯藏第18天時，Ca2+-ATPase 活性為0.29 U/mg 蛋白，僅為第0 天時的44.8%。

圖1 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體H+-ATPase活性的影響Fig.1 Effects of SNP treatment on the activity of mitochondrial H+-ATPase of ginger rhizomes

圖2 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體Ca2+-ATPase活性的影響Fig.2 Effects of SNP treatment on the activity of mitochondrial Ca2+-ATPase of ginger rhizomes

2.3 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體SDH 活性的影響

SDH 是三羧酸循環(huán)（TCA）和呼吸鏈上的一個重要酶，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一[17]。 貯藏過程中，對照組生姜根莖SDH 活性在整個貯藏期間呈緩慢下降趨勢。而SNP 處理組生姜根莖SDH 活性隨貯藏時間的延長呈先緩慢上升后下降的趨勢，并在第9 天達到最高峰，SDH 活性是對照組1.42倍，隨后SDH 活性隨貯藏時間延長逐漸降低（圖3）。說明SNP 處理生姜根莖在貯藏中后期有利于維持較高的SDH 活性， 從而有利于維持ATP 的合成能力，延緩生姜根莖衰老。

2.4 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體CCO 活性的影響

CCO 是線粒體電子傳遞鏈末端氧化酶， 能夠將電子從細胞色素C 傳遞給O2，以ATP 的形式為植物的多種生理活動提供能量[17]。 由圖4 可知，SNP 處理組生姜根莖CCO 活性在整個貯藏期間均顯著高于對照組。第3 天時，SNP 處理組和對照組生姜根莖CCO 活性降至最低，但SNP 處理的生姜根莖CCO 活性是對照的1.25 倍。在第12 天前，SNP 處理組和對照組生姜根莖CCO 活性變化趨勢都比較平緩，呈緩慢上升趨勢，表明這期間根莖內線粒體處于比較好的功能狀態(tài)。 到第15 天時，SNP 處理組和對照組生姜根莖CCO 活性均達到最大，SNP 處理組的CCO 活性是對照組的1.28倍。

2.5 采后SNP 處理對生姜根莖ATP、ADP 和AMP 含量及能荷的影響

圖3 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體SDH 活性的影響Fig.3 Effects of SNP treatment on mitochondrial SDH activity of ginger rhizomes

圖4 采后SNP 處理對生姜根莖線粒體CCO 活性的影響Fig.4 Effects of SNP treatment on mitochondrial CCO activity of ginger rhizomes

隨貯藏時間延長，生姜ATP 含量呈逐漸下降的趨勢，SNP 處理組生姜根莖ATP 含量在貯藏期第3～18 天內顯著高于對照組。 在常溫貯藏第18天時，SNP 處理組生姜根莖ATP 含量是對照組的1.96 倍（圖5a）。SNP 處理組生姜根莖ADP 含量顯著高于對照組，但SNP 處理組和對照組ADP 含量在采后貯藏過程中隨貯藏時間延長逐漸降低，貯藏第18 天時，SNP 處理組生姜ADP 含量是對照組的1.28 倍（圖5b）。 對照組和SNP 處理組生姜AMP 含量隨貯藏時間延長呈逐漸上升趨勢，但SNP 處理延緩了生姜AMP 含量的上升， 貯藏第18 天時SNP 處理組生姜AMP 含量僅為對照組的66.5%（圖5c）。 SNP 處理組生姜能荷隨貯藏時間延長逐漸降低但降低幅度趨平緩， 但對照組生姜能荷下降速度較快， 貯藏第18 天時，SNP 處理組和對照組生姜比貯藏第0 天下降了4.1%和13.7%（圖5d）。

圖5 采后SNP 處理對生姜根莖ATP（a）、ADP（b）、AMP（c）含量及能荷（d）的影響Fig.5 Effects of SNP treatment on the content of ATP （a）， ADP （b）， AMP （c）and energy charge （d）of ginger rhizomes

3 討論

果蔬采后貯藏過程中水分蒸騰、 呼吸作用和細胞壁物質降解等會引起果實品質下降、 組織衰老以及ATP 合成能力逐漸降低，從而導致線粒體功能下降，進而引起果蔬的代謝及生理功能紊亂[4，21]。已有研究表明，病原菌侵染、衰老和生理紊亂與細胞能量狀態(tài)密切相關[5，22-23]。 提高細胞ATP含量和能荷能夠延緩荔枝、桃、梨等果實的衰老，并且提高果實抗病性[19，24-25]。 本研究發(fā)現，采后SNP 處理維持了貯藏期間生姜根莖較高的ATP水平和能荷水平，從而延緩了根莖的衰老速度。采后誘抗劑處理延緩了枇杷、芒果、油、桃和南果梨果實ATP 含量的下降并維持了較高的能荷水平，從而延緩果實衰老和提高抗病性[19，26-29]。此外，外源提供ATP 可減輕病害的發(fā)生，并且維持較高的能荷水平[5，24]。而氧化磷酸化解偶聯劑2，4-二硝基苯酚（DNP）處理通過降低能量代謝而加重病害的發(fā)生[30]。 由此表明，采后誘抗劑處理延緩果實的衰老和提高抗脅迫能力與維持細胞較高能量水平相關。

H+-ATPase 和Ca2+-ATPase 是位于線粒體內膜上的主要呼吸代謝酶，負責合成和提供能量[31]。本研究發(fā)現，生姜根莖線粒體H+-ATPase 和Ca2+-ATPase 的活性隨貯藏時間延長逐漸下降，但SNP處理延緩了生姜根莖H+-ATPase 和Ca2+-ATPase的活性的下降。 本結果與南果梨、桃、芒果等果實中的研究結果一致[19，26，28]。 由此表明，SNP 處理可以通過提升能量代謝水平來保護細胞膜完整性和離子選擇滲透性，得以延緩生姜根莖衰老。SDH 是TCA 循環(huán)過程中的關鍵酶之一， 位于線粒體內膜上，也是線粒體的標志酶，其活性在一定程度上反應了線粒體的功能[20]。 CCO 位于線粒體電子傳遞鏈上，是呼吸鏈的末端氧化酶，將電子從細胞色素C 傳遞給O2，為氧化磷酸化提供能量[32]。 本研究發(fā)現，SNP 處理提高了貯藏過程中生姜根莖SDH 和CCO 的活性。 這與秋水仙堿對蓮霧貯藏過程中SDH 和CCO 活性的影響變化趨勢一致[32]。 本試驗中SNP 處理均提高了同一時期內4 種酶的活性，維持了線粒體良好的功能狀態(tài)進而延緩了生姜根莖的衰老。

4 結論

SNP 處理提高了采后生姜根莖線粒體H+-ATPase、Ca2+-ATPase、SDH 和CCO 的活性，延緩了生姜體內ATP、ADP 含量及能荷的下降，使生姜根莖維持較高的能量水平， 從而有效延緩生姜根莖采后衰老進程，更好地保持生姜根莖的品質。