藥用真菌對山藥基質(zhì)的雙向發(fā)酵適應性評價

李慧星 許 彬* 李 斌 郭書賢 李 杰

（1 南陽理工學院 生物與化學工程學院 河南南陽473004 2 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵重點實驗室 河南南陽473004）

山藥是我國的傳統(tǒng)食物， 也是藥食同源食物之一，為薯蕷科薯蕷屬（Dioscorea opposita）植物薯蕷的塊根[1]。 山藥中營養(yǎng)成分豐富，具有很強的抗氧化活性，含有豐富的山藥皂甙、山藥多糖等抗氧化活性成分[2-3]。 山藥皂甙對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基有較強的清除能力[4]，山藥多糖的抗氧化性隨著濃度的提高而顯著增強[5]。

山藥中碳水化合物主要是淀粉， 同時還含有一定量纖維素，可以作為藥用真菌發(fā)酵的底物；山藥中的其它成分，如蛋白質(zhì)、自由氨基酸、微量元素能促進藥用真菌的生長代謝和抗氧化活性物質(zhì)（如多糖、三萜）的生成[6]。同時，真菌在生長代謝過程中憑借菌絲的穿透能力、 水解酶和氧化酶的酶解能力[6-9]，可以解聚山藥基質(zhì)的細胞結構，促進抗氧化活性物質(zhì)（如山藥多糖、多酚、皂甙）的釋放。另外， 藥用真菌不僅本身能代謝產(chǎn)生具有抗氧化活性的物質(zhì)[8，10-11]，還可能對山藥基質(zhì)中某些成分進行轉(zhuǎn)化， 生成一些基質(zhì)中原本不具有的抗氧化活性物質(zhì)。 藥用真菌在山藥基質(zhì)上的發(fā)酵具有雙向性[12]，所得菌質(zhì)可能具有更高的抗氧化活性，可以開發(fā)成為具有抗氧化功能的食品， 從而顯著增加山藥的附加值。

本試驗基于雙向發(fā)酵技術， 利用云芝、 黑木耳、蛹蟲草、羊肚菌、銀耳、榆耳、香菇、靈芝、猴頭菌、豬苓10 種藥用真菌，以山藥作為培養(yǎng)基進行固態(tài)發(fā)酵。從山藥基質(zhì)被利用的狀況、菌質(zhì)的抗氧化活性以及培養(yǎng)耗時幾個方面，分析山藥-藥用真菌雙向發(fā)酵體系的適應性， 篩選出適應于山藥基質(zhì)的藥用真菌。以布滿時間、菌質(zhì)折干率、消耗率、抗氧化活性為指標， 利用主成分分析方法評價藥用真菌對山藥基質(zhì)的適應性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 馬鈴薯、山藥，購于家樂福超市；葡萄糖、瓊脂、水楊酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、連苯三酚，分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司；維生素B1，購于天津市光復精細化工研究所；瓊脂粉，購于北京奧博星生物技術有限責任公司；2，2-二苯基-1-苦基肼（TCI），購于合肥博美生物科技有限責任公司。

1.1.2 菌種 云芝（Trametes versicolor，50001）、黑木耳（Auricularia auricula，14008）、 蛹蟲草（Cordyceps militaris，14013）、 羊肚菌（Morchella sp.，14033）、銀耳（Tremella fuciformis，50179）、榆耳 （Gloeostereum incarnatum，14024）、 香菇（Lentinula sp.，14035）、 靈芝（Ganoderma lucidium，14025）、猴頭（Hericium erinaceus，14026）、豬苓（Polyporus umbellatus，14069），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.2 主要儀器設備

PHS-3C 精密pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；TDL-40C 低速臺式大容量離心機，湘儀離心機儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計， 北京普析通用儀器有限責任公司；0107 超聲波細胞破碎機，冠森生物科技；FreeZoneTriadFM2.5L 真空冷凍干燥機， 美國LABCONCO；TG16-WS 臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；LRHS-300-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；LDZX-30FB 立式滅菌器， 上海申安醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固體菌種制備 采用綜合PDA 培養(yǎng)基制備雙向發(fā)酵用菌種。將滅菌后的培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固后接種真菌的瓊脂菌塊，在25 ℃，RH 75%培養(yǎng)至菌絲布滿平板，備用。

1.3.2 山藥-藥用真菌雙向發(fā)酵方法 將山藥洗凈，切碎成2 mm 左右的顆粒，自然晾干（含水量10%）。 稱取25 g 干燥山藥裝于培養(yǎng)瓶中，添加蒸餾水，調(diào)整含水量為65%，浸潤2 h，得到山藥基質(zhì)。 將裝有山藥基質(zhì)的培養(yǎng)瓶置于121 ℃下滅菌30 min。

將1.3.1 節(jié)中所得固體菌種切成約1 cm 的菌塊，挑出接入山藥培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶接8 塊，每種菌種接兩瓶。將接種好的山藥培養(yǎng)基放入25℃，RH 75%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)時間20 d。 以不接種山藥培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.3 適應性評價指標

（1）布滿時間 按菌絲布滿培養(yǎng)瓶所需時間計算，單位：d

（2）折干率和消耗率[13]

折干率=干燥發(fā)酵后菌質(zhì)的質(zhì)量/發(fā)酵后菌質(zhì)的質(zhì)量×100%

消耗率=（原山藥質(zhì)量－干燥發(fā)酵后菌質(zhì)質(zhì)量）/原山藥質(zhì)量×100%

（3）自由基清除率測定

1）菌質(zhì)的提取 將發(fā)酵完成的山藥-藥用真菌菌質(zhì)用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥， 干燥完成后用研缽將干燥后的菌質(zhì)研成粉末狀。 用無水乙醇按固液比1∶5 超聲浸提10 min， 將浸提混合物在4 000 r/min 下離心30 min，傾倒清液，重復浸提一次，合并上清液備用。

2）羥自由基清除率的測定 參考文獻[14]測定菌質(zhì)提取物的羥自由基（·OH）清除率。

3）DPPH 清除率的測定 參照文獻[15]測定菌質(zhì)提取物的2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）清除率。

4）超氧自由基清除率的測定 參照文獻[16]測定菌質(zhì)提取物的超氧自由基（·O2）清除率。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 利用Matlab 對數(shù)據(jù)作主成分分析，分析前對數(shù)據(jù)進行歸一化處理[17]。

2 結果分析

2.1 各菌質(zhì)的比較

在試驗所選10 種真菌中榆耳（14024）和豬苓（14069）在山藥基質(zhì)上生長極其緩慢， 培養(yǎng)20 d時僅有局部生長，因此在分析中剔除這兩種菌種。

其余真菌與山藥雙向發(fā)酵后， 各菌質(zhì)的菌絲布滿天數(shù)、基質(zhì)折干率、消耗率、菌質(zhì)的·OH 清除率、DPPH 清除率、·O2清除率如表1 所示。

折干率反映了發(fā)酵后菌質(zhì)的含水量， 折干率越低，菌質(zhì)的含水量越高，菌質(zhì)中固相成分占比越少。靈芝（14025）折干率最高為38.58%。其次是銀耳（50179）為37.47%。 香菇（14035）和 蛹蟲草（14013）的折干率略低于銀耳， 但是折干率都在30%以上。 羊肚（14033）、黑木耳（14008）和猴頭（14026）的折干率在23%～25%左右，云芝（50001）的折干率最低為19.41%。 本試驗中各菌質(zhì)的折干率均低于空白對照，說明在發(fā)酵過程中，菌絲代謝基質(zhì)產(chǎn)生了水。

消耗率反映了菌種對山藥基質(zhì)的消耗情況，消耗率越高，說明基質(zhì)被菌種分解代謝的越多。試驗所選真菌中，云芝（50001）的消耗率最高，為59.99%。 羊 肚（14033）、黑 木 耳（14008）和 猴 頭（14026）差別不大， 消耗率均在43%左右。 香菇（14035）的消耗率居中，為26.45%。 銀耳（50179）的消耗率最低為7.37%。 蛹蟲草 （14013）、 靈芝（14025）的消耗率略高于銀耳，在11%～15%左右。本試驗中各菌質(zhì)的消耗率均高于空白對照， 說明在發(fā)酵過程中，菌種對山藥基質(zhì)均有分解作用，被分解的山藥基質(zhì)一部分轉(zhuǎn)化成菌絲體， 一部分轉(zhuǎn)化成了水、CO2等，因此引起菌質(zhì)質(zhì)量減少。

表1 試驗結果Table 1 Experiment result

各菌種自由基的清除率差距很大。 黑木耳（14008）、猴頭（14026）發(fā)酵后的菌質(zhì)·OH 清除率低于空白對照，云芝（50001）、羊肚（14033）、黑木耳（14008）發(fā)酵后，菌質(zhì)·O2清除率低于空白對照，羊肚（14033）發(fā)酵后的菌質(zhì)DPPH 清除率低于空白對照。這有可能是在發(fā)酵過程中，菌絲分解掉了山藥本身具有自由基清除能力的成分， 而代謝產(chǎn)物的自由基清除能力低于山藥原成分。

2.2 主成分分析

對表1 中的原始數(shù)據(jù)歸一化后采用Matlab進行主成分分析，得到載荷矩陣如表2 所示。

表2 主成分分析旋轉(zhuǎn)后的成分載荷矩陣Table 2 Rotated component matrix of PCA （principle component analysis）

在山藥基質(zhì)上能進行雙向發(fā)酵的菌種， 不僅能消耗山藥基質(zhì)供自身生長， 還能形成具有更強抗氧化活性的真菌-山藥菌質(zhì)，既該菌種對山藥基質(zhì)具有雙向發(fā)酵適應性。

第1 個主成分F1 綜合了折干率、 消耗率、自由基清除率的信息， 其中折干率在第1 主成分上呈正向載荷分布、消耗率呈負向載荷分布，自由基清除率呈正向載荷分布。即當折干率越高、消耗率越低、各個自由基清除率越高時，F(xiàn)1 越大。 所以可認為F1 是雙向發(fā)酵適應性因子。第二主成分主要包含布滿天數(shù)的信息，呈正向載荷分布，可以認為F2 是雙向發(fā)酵耗時因子。

各主成分的方差及累計貢獻率如表3 所示。

表3 方差及累計貢獻率Table 3 Variance and accumulative variance contribution

主成分數(shù)目的選定既要滿足數(shù)據(jù)降維目的又希望綜合盡可能多的信息， 常用累積方差貢獻率不低于某一閾值（如85%）來確定主成分[18-20]。本試驗中前兩個主成分的累計貢獻率為89.36%，因此可以保留前2 個主成分進行后續(xù)的分析。

主成分的得分矩陣，如表4 所示。

利用表4 中主成分得分繪制得分圖， 主成分分析F1、F2 得分圖如圖1 所示。

本研究中第1 主成分F1、 第2 主成分F2 分別包含了原來信息量的61.01%和28.35%。許多研究者采用主成分分析得分圖反映樣品與樣品指標之間關系[19-20]，由圖1 能夠直觀地看出各真菌菌質(zhì)與主成分F1 和F2 的關系。 靈芝（14025）、香菇（14035）落在F1、F2 的第1 區(qū)間內(nèi)，兩者在山藥基質(zhì)上發(fā)酵緩慢，但具有良好的雙向發(fā)酵適應性。靈芝對山藥基質(zhì)的分解程度比香菇低， 但菌質(zhì)的自由基清除能力高， 因此可以認為靈芝對山藥基質(zhì)具有更好的雙向發(fā)酵適應性。 但靈芝的生長速度緩慢，發(fā)酵耗時長。黑木耳（14008）和猴頭（14026）落在F1、F2 第2 區(qū)間內(nèi)， 說明這兩種真菌在山藥基質(zhì)上生長緩慢，且雙向發(fā)酵適應性差，基質(zhì)被真菌分解程度高， 但菌質(zhì)不具有更強的自由基清除能力。 羊肚菌（14033）和云芝（50001）落在F1、F2第3 區(qū)間內(nèi)，它們在山藥基質(zhì)上生長較快，對山藥基質(zhì)的分解程度較高， 但所得菌質(zhì)的自由基清除能力較低，雙向發(fā)酵適應性較差。蛹蟲草（14013）、銀耳（50179）落在F1、F2 第4 區(qū)間內(nèi)，它們對山藥基質(zhì)的分解程度較低， 而所得菌質(zhì)的自由基清除能力較高，具有雙向發(fā)酵適應性，而且發(fā)酵耗時少。

表4 主成分得分矩陣Table 4 Component score matrix

圖1 主成分分析F1（雙向發(fā)酵適應性因子）、F2（雙向發(fā)酵耗時因子）得分圖Fig.1 PCA scores on F1（bidrectional-fermentation adaptability factor ）and F2（fermentation time-consuming factor）

3 結論

山藥可以作為多種藥用真菌的培養(yǎng)基質(zhì)，經(jīng)真菌發(fā)酵后形成的菌質(zhì)整體上具有更強的抗氧化活性。

真菌在山藥基質(zhì)上的生長速度一方面由真菌本身性質(zhì)決定， 另一方面也受到基質(zhì)成分是否易于被真菌利用的影響。 本試驗中所分析菌株均能在山藥培養(yǎng)基上蔓延生長， 且菌絲能在基質(zhì)上均勻分布，說明山藥培養(yǎng)基能為這些菌種提供營養(yǎng)，這與楊海龍[6]的報道一致。但因菌種本身生長速度存在差異， 所以菌絲布滿培養(yǎng)基所需的時間差別較大。不同菌種對山藥基質(zhì)的利用程度不同，發(fā)酵后所得菌質(zhì)的抗氧化活性也因菌種的不同而存在差異。

藥用真菌對山藥基質(zhì)的適應性差別較大。 依據(jù)主成分解釋及各主成分的方差及累計貢獻率，從總變量中提取了2 個主成分， 反映原變量的89.36%的信息。 第一個主成分F1 綜合了折干率、消耗率、 自由基清除率的信息即雙向發(fā)酵適應性因子， 第二主成分主要包含培養(yǎng)天數(shù)的信息即雙向發(fā)酵耗時因子。 結合主成分得分圖， 靈芝（14025）、香菇（14035）、蛹蟲草（14013）和銀耳（50179）對山藥基質(zhì)具有良好的適應性。其中靈芝對山藥基質(zhì)的適應性最好，但發(fā)酵耗時也最長。這可能與靈芝本身生長速度緩慢有關。 銀耳和蛹蟲草在山藥基質(zhì)上生長迅速， 所得菌質(zhì)也具有較高的抗氧化活性。