利用體外發(fā)酵模型研究葉綠素對(duì)兒童腸道菌群的影響

李媛媛 歐雅文 崔 羽 張 燕

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083）

隨著生活水平的提高，居民高脂肪、高蛋白飲食的攝入使肥胖、 高血脂等代謝疾病的發(fā)病率在全世界普遍上升[1]。 為了降低肥胖發(fā)生率，緩解這一健康問題，2016年美國農(nóng)業(yè)部和中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)分別修訂了各自的膳食指南， 指南中均明確提出增加蔬菜的攝入量[2-3]。 葉綠素作為綠色蔬菜中含量最為豐富的色素，其決定了果蔬的品質(zhì)特征，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其還具有降低膽固醇， 調(diào)節(jié)腸道功能，抗突變等生理功能[3]。近年來，隨著深色蔬菜中花色苷、多酚等非營養(yǎng)物質(zhì)研究的深入，攝入蔬菜后葉綠素的生物活性和營養(yǎng)價(jià)值引起研究人員的重視， 目前人們對(duì)葉綠素的生物活性作用的了解還十分有限[4]。

人體腸道中含有大量的與宿主共存的微生物，這些菌群共同構(gòu)成了人體獨(dú)特的腸道環(huán)境，個(gè)體的腸道菌群種類和豐度都不同[5]。 近年來，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對(duì)宿主的健康作用受到研究者們極大的關(guān)注。 大量研究表明胎兒出生時(shí)腸道沒有細(xì)菌定植，出生7～10 d 開始需氧菌或兼性厭氧菌的先期定植和繁殖， 從此經(jīng)歷了腸道菌群從無到有，從簡單到復(fù)雜的過程，出生至2 歲嬰兒期是腸道菌群形成并達(dá)到平衡的最重要時(shí)期， 此期的菌群決定了機(jī)體日后免疫應(yīng)答和代謝等[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)， 葉綠素對(duì)乳酸鏈球菌的生長特性及代謝水平均有顯著影響， 而乳酸菌作為人體腸道中的有益菌，在人體腸道中能發(fā)揮營養(yǎng)功能作用[9]。 嬰兒剛出生后， 最初腸道菌群中以乳酸菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，隨著嬰兒的成長，腸道菌群中乳酸菌屬數(shù)量反而下降[4]，這一結(jié)果值得深入研究。

基于此，本試驗(yàn)以葉綠素為對(duì)象，研究其對(duì)不同年齡兒童（2 歲和5 歲）腸道菌群的影響，探究葉綠素是否會(huì)影響兒童腸道菌群中乳酸菌屬的豐度等， 幫助人們了解葉綠素的早期攝入與健康的關(guān)系， 從營養(yǎng)角度為綠色蔬菜的攝入提供合理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

新鮮菠菜（Spinacia oleracea L.），中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；2 歲健康兒童1 名（重復(fù)取糞便樣本5 次）；5 歲健康兒童1 名 （重復(fù)取糞便樣本5 次）；色譜級(jí)甲醇、三氯甲烷、乙腈、正己烷，美國Thermo fisher 公司； 濃硫酸、95%無水乙醇、厭氧肉湯培養(yǎng)基、L-半胱氨酸鹽酸鹽、刃天青等均為分析純?cè)噭?，試?yàn)中所用的水均為超純水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備與儀器

CR21GⅢ型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；DHP-9082 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；JYDZ-31B 九陽打漿機(jī)， 九陽股份有限公司；Acquit UPLC 液相色譜儀 （UPLC）， 美國Agilent 公司；T6 新世紀(jì)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葉綠素制備 參照Rivera-Chávez 等[7]的方法提取新鮮菠菜中的葉綠素。 將洗凈晾干的菠菜葉去梗，放攪拌機(jī)中，并倒入適量乙醇（料液比1∶3），攪拌成漿。4 ℃，8 000 r/min 離心6 min，所得上清液在36 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)濃縮，獲得葉綠素濃漿，隨后測(cè)定葉綠素濃度。用移液槍吸取1 mL 葉綠素濃縮液， 梯度稀釋100 倍后分別在645，663 nm 處測(cè)吸光度值OD， 以體積分?jǐn)?shù)80%的丙酮為對(duì)照。 葉綠素水平計(jì)算公式如下：

Ca=12.71A663-2.59A645

Cb=22.88A645-4.67A663

C=Ca+Cb=8.04A663+20.29A645

本試驗(yàn)中， 得到葉綠素溶液平均質(zhì)量濃度為7 mg/mL。

1.3.2 體外糞便發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 參照Parkar 等[8]的方法，對(duì)采集到的受試者的糞便樣本發(fā)酵24 h，體外模擬腸道菌群的變化。試驗(yàn)前，將所有緩沖液置于N2環(huán)境下24 h。向pH 6.8 的厭氧肉湯培養(yǎng)基中添加0.05%過濾消毒的L-半胱氨酸鹽酸鹽和0.00005%的刃天青的發(fā)酵培養(yǎng)液分裝于厭氧瓶中，充氮密封，滅菌。 而后向厭氧培養(yǎng)管中用注射器分別加入葉綠素樣品10 mL 以及10%糞便懸液10 mL，混合振蕩，厭氧環(huán)境37 ℃搖床（70 r/min）總計(jì)培養(yǎng)24 h， 取發(fā)酵液時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為0，4，8，12，16，20，24 h。

1.3.3 腸道菌群豐度及多樣性測(cè)定 分別取不同處理的糞便樣本， 采用MoBio 公司PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit 試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取， 具體步驟按說明書操作，所提取的DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?使用Promega公司的GoTaqRHot Start Colorless Master Mix 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 引物為16S V4 區(qū)特異引物515 F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）-806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）， 產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，Qiagen公司的QIAquickRPCR Purification Kit 試劑盒純化回收產(chǎn)物， 并使用Pico Green 熒光定量以及Agilent 2200 TapeStation 電泳工作平臺(tái)檢測(cè)，合格后使用Illumina 公司的Miseq 設(shè)備測(cè)序進(jìn)行上機(jī)測(cè)序及菌群數(shù)據(jù)相關(guān)分析。

1.3.4 短鏈脂肪酸及有機(jī)酸HPLC 法測(cè)定 采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）測(cè)定有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等乳酸菌代謝產(chǎn)物的變化趨勢(shì)[9]。 具體試驗(yàn)方法如下：分別配制乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、乳酸等標(biāo)準(zhǔn)品的系列濃度梯度， 用0.22 μm 的水相濾膜進(jìn)行過濾，濾液用高效液相色譜法測(cè)定，定量分析后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 用于后續(xù)有機(jī)酸和短鏈脂肪酸含量的計(jì)算。 HPLC 條件為：用超純水作為流動(dòng)相A， 在13 mm 水系濾膜下過濾后的0.005 mol/L H2SO4作為流動(dòng)相B， 等梯度洗脫， 流速0.5 mL/min，柱溫65 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長210 nm。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul, MN）軟件包中Linear Models 程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD 程序，采用Origin 8.1（Microcal Software，Inc.，Northampton USA）制圖軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉綠素對(duì)腸道菌群多樣性的影響

菌群多樣性分析采用香農(nóng)指數(shù)，指數(shù)值越大，代表群落多樣性程度越高。Clarke 等[10]研究表明菌群多樣性的減少與健康問題相關(guān)， 將各組間及各個(gè)樣本的多樣性指數(shù)進(jìn)行比較，如圖1 所示。 圖1（A-24 h）中，分析2 歲兒童腸道菌群多樣性的變化發(fā)現(xiàn)，添加葉綠素使菌群多樣性顯著降低，發(fā)酵24 h 多樣性指數(shù)由2.6～3.2 降至2.4～2.7， 平均多樣性降低14%。 同樣在圖1（B-24 h）中顯示，5 歲兒童糞便發(fā)酵24 h 后，添加葉綠素也使菌群多樣性由2.5～2.8 降至1.8～2.4，平均多樣性降低19%。可見， 葉綠素顯著降低腸道菌群多樣性。 Sommer等[11]研究發(fā)現(xiàn)菌群多樣性會(huì)影響宿主的健康發(fā)展，多樣性越高可能會(huì)產(chǎn)生更多的積極作用。但本試驗(yàn)中對(duì)前20 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)降低的菌屬主要包括擬桿菌屬（Bacteroides）、 雙岐菌屬（Bifidobacterium）、 未分類的腸桿菌（Unclassified Bacillales）、 未分類的瘤胃科菌屬（Unclassified Ruminococcaceae）、霍亂弧菌（Dialister），除擬桿菌屬（Bacteroides）、雙岐菌屬（Bifidobacterium）外，其它有所下降的菌屬均對(duì)人體有不利的影響， 因此本試驗(yàn)結(jié)果中， 葉綠素降低了兒童腸道菌群多樣性是否對(duì)兒童健康有影響，仍需要進(jìn)一步研究。

圖1 香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）變化Fig.1 Changes of Shannon index

2.2 葉綠素對(duì)腸道菌群相對(duì)豐度的影響

2.2.1 群落組成分析 腸道菌群門和屬的平均值如圖2 所示， 通過對(duì)測(cè)序樣品的序列進(jìn)行比對(duì)分析，人體腸道菌群序列主要分屬于4 個(gè)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門 （Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。 剩余的序列分別包括黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、梭桿菌門（Fusobacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、軟壁菌門（Tenericutes）和疣微桿菌門（Verrucomicrobia）， 另外還包括未分類的細(xì)菌。

在屬（genus）的水平上，可以看出，人體腸道中含量較多的菌屬包括變形菌門中的埃希氏-志賀菌屬（Escherichia_Shigella）、 普雷沃菌屬（Prevotella）、小類桿菌（Dialister）、腸球菌屬（Enterococcus）、 腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriaceae），擬桿菌門中的擬桿菌屬（Bacteroides），放線菌門中的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、柯林斯菌（Collinsella）。 下面對(duì)有差異的菌屬進(jìn)行分析。

2.2.2 屬水平的差異分析 雙歧桿菌屬相對(duì)豐度變化如圖3a 所示，2 歲兒童樣本中，添加葉綠素顯著降低了雙歧桿菌屬的豐度（P<0.05），發(fā)酵12 h時(shí)，由4.7%下降至2.8%，約下降39%。 與2 歲兒童樣本不同，5 歲兒童樣本中雙歧桿菌屬豐度無顯著性差異 （P>0.05）， 發(fā)酵12 h 時(shí)微量上升。Huang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌屬具有較高的營養(yǎng)功能，如快速降解乳糖、產(chǎn)生乳酸和短鏈脂肪酸、輔助消化吸收、 通過菌膜屏障及產(chǎn)生雙歧桿菌素抑制多種致病菌等， 在母乳喂養(yǎng)的0～1 歲兒童腸道內(nèi)豐度較高。 在本試驗(yàn)中推測(cè)兩歲兒童樣本中雙歧桿菌屬豐度的降低可能與樣本年齡及腸道菌群穩(wěn)定性相關(guān)， 因?yàn)? 歲兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)此時(shí)為飲食方式影響階段， 葉綠素的攝入可能對(duì)2歲兒童菌屬的影響較大[6]。 此外，Krautkramer 等[12]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌屬作為人體腸道內(nèi)的益生菌，在人體腸道定植較難，且受環(huán)境、飲食等因素影響較大，因此，葉綠素的攝入可能造成2 歲兒童雙歧桿菌屬豐度的降低， 而5 歲兒童此時(shí)的腸道菌群已經(jīng)趨于穩(wěn)定， 因此葉綠素?cái)z入對(duì)5 歲兒童腸道菌群中的雙歧桿菌屬豐度影響較小。 值得注意的是雙歧桿菌屬豐度的降低是否對(duì)2 歲兒童的健康產(chǎn)生影響，目前尚不可知，進(jìn)一步的研究仍需進(jìn)行。

圖2 腸道菌群門和屬的平均值Fig.2 The average value of phylum and genus of gut microbiota

柯林斯菌是放線菌門中的主導(dǎo)菌， 其相對(duì)豐度變化如圖3b 所示，葉綠素使兒童腸道菌群中柯林斯菌屬的相對(duì)豐度顯著下降（P<0.05）， 其中2歲兒童12 h 樣本中柯林斯菌屬相對(duì)豐度由3.1%下降至1.9%， 下降率約36%；5 歲兒童12 h 樣本中柯林斯菌屬相對(duì)豐度由1.7%下降至0.4%，下降率約68%。 Rosenbaum 等[14]研究發(fā)現(xiàn)柯林斯菌屬的豐度與促炎細(xì)胞因子IL-17A 水平呈正相關(guān)，柯林斯菌屬的相對(duì)豐度越高，促炎因子IL-17A 分泌水平越高。 IL-17A 能通過誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞產(chǎn)生分泌型抗體IgA， 進(jìn)而對(duì)免疫系統(tǒng)起調(diào)節(jié)作用。 Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化病人糞便菌群中柯林斯菌屬數(shù)量會(huì)上升， 且與高密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人、潰瘍性結(jié)腸炎病人腸道中柯林斯菌屬豐度也發(fā)生改變， 因此結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)葉綠素可能通過降低柯林斯菌屬的相對(duì)豐度實(shí)現(xiàn)對(duì)人體的健康作用。

葉綠素對(duì)乳酸菌屬豐度的影響如圖3c 所示。發(fā)酵12 h 時(shí)兒童樣本腸道菌群中乳酸菌屬豐度均有所上升， 其中2 歲兒童糞便中乳酸菌屬的豐度增加更顯著（P<0.05），這與實(shí)驗(yàn)室前期研究葉綠素對(duì)乳酸鏈球菌生長特性及代謝產(chǎn)物的影響結(jié)果一致，和對(duì)照組相比，葉綠素顯著增加乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)物水平， 證明了葉綠素具有一定的生物活性作用。 Terayama 等[16]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌屬在宿主腸道中屬于有益菌，對(duì)宿主有解毒、降血脂抗癌等多種健康作用。 此外，張海均等[17]研究發(fā)現(xiàn)大鼠在飲用亞硝酸鹽含量較高的泡菜水時(shí)， 同時(shí)攝入石榴皮中的多酚提取物， 發(fā)現(xiàn)多酚提取物能通過提高大鼠腸道菌群中乳酸菌數(shù)量， 促進(jìn)亞硝酸鹽的降解達(dá)到解毒目的。因此，本試驗(yàn)結(jié)果顯示葉綠素可能與多酚類非營養(yǎng)物質(zhì)一樣， 能促進(jìn)乳酸菌屬豐度的上升，促進(jìn)對(duì)宿主的解毒作用。

圖3 兒童腸道中雙歧桿菌屬、柯林斯菌屬、乳酸菌屬相對(duì)豐度 （12 h）Fig.3 The relative abundance of Bifidobacterium， Collinsella， Lactobaillus in children’s gut （12 hours）

2.3 葉綠素對(duì)腸道菌群代謝物的影響

圖4～圖6 為發(fā)酵24 h 時(shí)葉綠素對(duì)兒童腸道菌群代謝物水平的影響，主要探討乳酸、乙酸、丙酸的變化趨勢(shì)。 如圖4 所示，添加葉綠素促進(jìn)了5歲兒童腸道菌群代謝物乳酸水平顯著上升（P<0.05），由發(fā)酵24 h 的42 μg/mL 升至101 μg/mL，2歲兒童樣本中乳酸水平同5 歲兒童樣本呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。 Fung 等[18]綜述了腸道中的乳酸能給腸道環(huán)境提供穩(wěn)定的酸性環(huán)境， 抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸， 促進(jìn)丙酮酸參與三羧酸循環(huán)， 進(jìn)行糖酵解，促進(jìn)宿主的身體代謝。因此結(jié)合上述乳酸菌屬變化趨勢(shì)可推測(cè)本研究中葉綠素可能通過促進(jìn)腸道中乳酸菌數(shù)量的生長， 促進(jìn)不同年齡兒童腸道菌群代謝物乳酸水平上升。

發(fā)酵24 h 葉綠素對(duì)腸道菌群產(chǎn)乙酸水平的影響如圖5 所示。 由圖5 可知添加葉綠素促進(jìn)5歲兒童腸道菌群代謝物乙酸水平顯著上升， 發(fā)酵24 h 由0.23 μg/mL 升至0.3 μg/mL（P<0.05），同樣的， 添加葉綠素也顯著促進(jìn)2 歲兒童樣本中乙酸水平的上升（P<0.05）。

發(fā)酵24 h 葉綠素對(duì)腸道菌群產(chǎn)丙酸水平的影響如圖6 所示。添加葉綠素后發(fā)酵24 h 時(shí)，5 歲兒童腸道菌群代謝物丙酸水平由0.34 μg/mL 上升至0.39 μg/mL（P<0.05），而2 歲兒童樣本中丙酸水平微量下降，可能由于2 歲兒童年齡較小，且個(gè)體的腸道菌群差異較大， 因此代謝物種類和水平均有差異。兒童腸道菌群代謝物乙酸、丙酸水平的上升可能是由于葉綠素促進(jìn)產(chǎn)乙酸、 丙酸相關(guān)的菌群的生長，或促進(jìn)菌群對(duì)乙酸、丙酸的分泌，但仍需進(jìn)一步試驗(yàn)證明葉綠素與菌群的關(guān)系。 Fung等[18]研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸微量的增加也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生積極的健康作用， 如丁酸鹽在mmoL 濃度下就能發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增值、分化，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 Voltolini 等[19]研究發(fā)現(xiàn)乙酸、丙酸均能促進(jìn)宿主的健康發(fā)展， 包括保護(hù)宿主腸道上皮細(xì)胞完整性，提供能量以及抗癌作用。 因此，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠素能促進(jìn)乙酸、 丙酸水平的微量上升， 是進(jìn)一步理解葉綠素生物活性實(shí)現(xiàn)的可能途徑。

圖4 乳酸水平的變化Fig.4 Change of lactic acid

圖5 乙酸水平的變化Fig.5 Change of acetic acid

圖6 丙酸水平的變化Fig.6 Change of propionic acid

3 結(jié)論

本研究通過體外分別對(duì)不同年齡段兒童糞便進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)， 對(duì)腸道菌群進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，對(duì)菌群豐度和多樣性進(jìn)行分析，同時(shí)測(cè)定菌群代謝物水平變化， 探究葉綠素對(duì)腸道菌群的影響，結(jié)論如下：葉綠素的添加降低了兒童腸道菌群多樣性， 由于兒童樣本在年齡、 個(gè)體方面存在差異，葉綠素對(duì)其作用效果也存在差異。兒童糞便中微生物以放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為主。屬水平上添加葉綠素促進(jìn)柯林斯菌、雙岐菌屬相對(duì)豐度的下降，乳酸菌屬相對(duì)豐度上升；且比較5 歲兒童樣本，在2 歲兒童樣本中，食源性物質(zhì)的攝入對(duì)雙岐菌屬、 乳酸菌屬這類人體腸道不易定植的菌屬影響較大，此外，攝入葉綠素有助于增加不同年齡兒童腸道菌群代謝物乳酸、 乙酸的水平。