膳食補充芝麻素對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知障礙的改善作用及機制

馬少博 李 鈴 劉志剛 劉學(xué)波

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100）

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和醫(yī)療健康領(lǐng)域的進步，我國社會人口結(jié)構(gòu)老齡化趨勢愈加明顯。目前我國超過65 周歲的老齡化人群已達到總?cè)藬?shù)的11.4%， 并且預(yù)計在2035年達到總?cè)藬?shù)的20%左右，促使中國進入深度老齡化階段[1]。 隨著這一社會問題的加劇，衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茲海默癥、帕金森癥等腦健康問題日益凸顯。阿爾茨海默癥（Alzheimer’s Disease，AD）又稱為老年癡呆癥，是一種與衰老相關(guān)的精神退行性疾病，其特征是記憶力逐漸減退并伴隨著認(rèn)知障礙[2-3]。目前它的發(fā)病機制尚未明確， 而AD 往往伴隨著Aβ 的沉積、神經(jīng)炎癥的發(fā)生和Tau 蛋白的過度磷酸化[4]。 Tau 蛋白的過度磷酸化已被證明與胰島素信號的抑制相關(guān)[5]。 近年來，通過調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)干預(yù)并改善腦健康已經(jīng)成為食品營養(yǎng)學(xué)的研究熱點。 已有大量研究從植物中分離出多種具有潛在神經(jīng)保護作用的多酚、類胡蘿卜素、木脂素類活性成分[6-9]。

芝麻素是我國特色油料作物芝麻中的一種主要的木脂素類活性物質(zhì)， 在芝麻籽中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.5%[10]，分子式為C20H18O6，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1a 所示。 研究表明，芝麻素具有抗氧化、抗衰老、抗炎、 減少動脈粥樣硬化和抗高血壓等生理功能[11-14]，可作為膳食減脂補充劑。有研究[6-7]證明，膳食補充芝麻素可抑制慢性壓力模型小鼠中腦部神經(jīng)炎癥， 增加突觸可塑性并改善小鼠認(rèn)知及情緒障礙，還可以防止慢性壓力引起的神經(jīng)元損害。此外，芝麻素可以抑制由6-羥基多巴胺毒性引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞異常激活[15]。 然而，目前鮮有文獻報道芝麻素能夠改善與衰老相關(guān)的腦健康問題。

本研究選用APP/PS1 轉(zhuǎn)基因（AD 模型）小鼠作為認(rèn)知障礙動物模型， 通過飲食補充芝麻素3個月， 采用行為學(xué)測試評估芝麻素干預(yù)對小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用。通過免疫組化、免疫印跡試驗（Western blot）等方法探究補充芝麻素對小鼠腦部神經(jīng)炎癥及神經(jīng)損傷的改善作用及機制，為通過食源性補充芝麻素的方式預(yù)防和改善衰老導(dǎo)致的認(rèn)知障礙、 神經(jīng)炎癥等腦健康問題提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻素（98%，S25758），源葉生物技術(shù)有限公司（中國上海）；TRIzol 試劑，金彩生物技術(shù)有限公司；RNA 提取試劑盒、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PCR 試劑盒， 大連TaKaRa 公司；IBA-1 和PSD-95 一抗，美國Cell Signaling Technology 公司；山羊抗兔IgG 熒光二抗（goat anti-rabbit，4413）及山羊抗鼠 IgG （H+L）熒光二抗 （goat anti-mice，4408），美國Cell Signaling 公司；抗熒光衰減封片劑（S2110），北京索萊寶公司；細(xì)胞裂解緩沖液，中國江蘇博伊泰生物技術(shù)研究所； 組織蛋白提取試劑及BCA 蛋白試劑盒， 中國上海Thermo Fisher公司；中性樹膠以及蘇木精-伊紅，南昌雨露實驗器材有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

莫里斯水迷宮（XR-XM101），上海欣軟信息科技有限公司；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus 公司；電泳裝置（PowerPac 220V），美國伯樂公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocTMXRS），美國伯樂公司；臺式高速冷凍離心機（5417R），德國Eppendorf 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物實驗分組 6月齡的雌性B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo 轉(zhuǎn)基因小鼠， 由南京大學(xué)模式動物研究中心提供。小鼠具體分組（n：5～7）及飼喂方式見表1。 標(biāo)準(zhǔn)飼料（AIN93M）及含有芝麻素的飼料均由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。 用不同飼料干預(yù)小鼠3 個月后進行行為學(xué)試驗，在此期間每4 d 記錄1 次體重，每天記錄食物和水的攝入量。行為學(xué)試驗后通過腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，眼眶取血后脫頸處死小鼠，解剖后取出腦組織保存在-80 ℃，后續(xù)再進行生化分析。 具體試驗操作參照圖1b。 所有試驗程序遵循動物倫理委員會試驗動物護理和使用指南 （第8版），ISBN-10：0-309-15396-4。 該動物試驗方案已獲得西北農(nóng)林科技大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

表1 實驗小鼠分組及飼料劑量Table 1 Group of experimental mice and dosage of diets

圖1 芝麻素的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及試驗操作的時間軸Fig.1 Chemical structure of sesamin and scheme for experiments

1.3.2 行為學(xué)試驗 采用莫里斯水迷宮探究小鼠認(rèn)知記憶功能， 具體試驗方法根據(jù)參考文獻[16]。本試驗主要利用小鼠厭水特性， 分別對小鼠進行適應(yīng)性訓(xùn)練、 定位巡航、 空間探索3 個步驟的試驗。水迷宮為直徑1 m，高35 cm 的圓形水臺，其內(nèi)部安置1 個圓形小水臺供小鼠尋找。 在開始試驗前， 水迷宮被分為4 個象限并在水池壁上放上不同標(biāo)識，作為動物的認(rèn)知參考。試驗期間利用視頻記錄設(shè)備記錄小鼠游動時間、距離與軌跡。在適應(yīng)性訓(xùn)練后小鼠休息1 d 并進行定位巡航試驗，記錄小鼠在第1，3，5，7 天找到迷宮中小平臺所用時間， 以及第8 天空間探索試驗中小鼠在目標(biāo)象限的游泳路程，計算在目標(biāo)象限路程占比：

1.3.3 樣本收集及指標(biāo)測定

1.3.3.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 將腦組織包埋在石蠟中，用切片機切成6 μm 的組織薄片，使用蘇木精和曙紅（H&E）染色并通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光的方法將切片與不同抗體孵育，封片后，分別使用普通光學(xué)顯微鏡、 熒光顯微鏡觀察海馬的CA1區(qū)域， 具體觀察組織形態(tài)、 突觸后致密蛋白-95（post-synaptic density protein 95，PSD-95）、小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)下的標(biāo)志物 （ionized calcium binding adaptor molecule 1，IBA-1）及Aβ 的沉積。 具體方法見文獻[17]。

1.3.3.2 mRNA 水平相對含量測定 按照RNA提取試劑盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）說明書的方法在冷凍組織中提取RNA，測定RNA 含量后， 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 按照SYBR PCR 試劑盒說明書添加SYBR 熒光染料及特定引物形成反應(yīng)體系 （引物序列見表2），用PCR 儀擴增，2-△△Ct方法分析基因PSD-95、 白細(xì)胞介素-1 （interleukin 1 beta，IL-1β）、 胰島素降解酶 （insulin-degrading enzyme，IDE）以及IBA-1 在mRNA 水平的相對表達量。

表2 實時定量PCR 所用引物序列Table 2 Primer sequences used for semi-quantitative RT-PCR analysis

1.3.3.3 蛋白水平相對含量測定 將大腦皮層組織在低溫勻漿， 按照組織蛋白提取試劑盒說明書提取組織中蛋白。使用BCA 蛋白質(zhì)試劑盒確定組織中總蛋白質(zhì)濃度。 將蛋白溶解在SDS 樣品緩沖液中， 然后立即在95 ℃加熱10 min。 通過SDSPAGE 分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。 孵育對應(yīng)抗體后，用化學(xué)發(fā)光試劑觀察免疫反應(yīng)帶，并通過蛋白質(zhì)印跡來測定AD 相關(guān)基因在蛋白水平的相對表達量。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析 試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，使用Graphpad Prism 6.0 軟件的Newman-Keuls 檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 由于試驗為雙因素， 因此顯著性分析選擇two-way ANOVA。P<0.05 為差異具有顯著性，P<0.01 為差異具有極顯著性。 若P<0.05，則均值被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠體重、 飲水及攝食的影響

由圖2a 可知，4 組小鼠的體重在飼養(yǎng)的9 周內(nèi)均無顯著性差異（P>0.05）。 為了探究體重與攝食量之間的關(guān)系， 每天記錄小鼠攝食， 結(jié)果如圖2c 所示，4 組的攝食量沒有出現(xiàn)顯著性差異 （P>0.05），這說明芝麻素對野生型小鼠及APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的體重?zé)o顯著影響。 由圖2b 可知，飼喂含有芝麻素飼料的野生型小鼠 （WT+SE 組）和APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠（AD+SE 組）的飲水量顯著低于飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料的野生型小鼠（WT 組）和APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠（AD 組）（P<0.01）。

圖2 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠體重、飲水量及攝食量的影響Fig.2 Effects of sesamin treatment on the body weight， water intake and food intake in APP/PS1 transgenic mice

2.2 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知障礙的影響

利用水迷宮對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知能力進行測試。 如圖3a 所示，在第7 天定位巡航試驗的軌跡圖中，AD 組小鼠尋找平臺的軌跡距離為最長，而AD+SE 組軌跡距離明顯縮短。 在定位巡航實驗中，如圖3b 所示，不同組的逃避潛伏期存在差異。 在第7 天的測試中，與WT 組小鼠相比，AD 組的小鼠尋找平臺所需時間顯著增加 （P<0.05）。同時，與AD 組相比，AD+SE 組小鼠的逃避潛伏期顯著減少（P<0.05）。 以上結(jié)果表明補充芝麻素能夠改善APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知障礙。

圖3 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知障礙的影響Fig.3 Effects of sesamin treatment on the cognitive disorder in APP/PS1 transgenic mice

在空間探索試驗中， 主要記錄小鼠在目標(biāo)象限中的路程占比， 路程占比越高小鼠認(rèn)知能力越強。 如圖3c 所示，與WT 組小鼠相比，雖然WT+SE 組的小鼠在目標(biāo)象限中的路程占比更高，但是無顯著性（P>0.05）。同樣地，與AD 組相比，AD+SE組小鼠在目標(biāo)象限中的路程占比增加。 這一結(jié)果說明補充芝麻素能夠提升APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知能力。 綜上，補充芝麻素能夠顯著改善AD 引起的認(rèn)知障礙。

2.3 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中神經(jīng)元損傷和突觸功能障礙的預(yù)防作用

2.3.1 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元損傷的影響 采用蘇木精和伊紅染色 （H &E）的方法觀察小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分布情況，由圖4a 所示，與WT 組相比，AD 組小鼠的海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元排列明顯斷裂，且有神經(jīng)元丟失甚至核固縮的現(xiàn)象。 而膳食補充芝麻素后能改善阿爾茲海默癥造成的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，減少神經(jīng)元的碎片化及凋亡。 由此可見，芝麻素可抑制由阿爾茲海默癥造成的神經(jīng)元損傷。

2.3.2 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠突觸功能障礙的影響 采用免疫熒光觀察小鼠海馬PSD-95蛋白水平的表達與分布情況， 并通過RT-PCR 和Western-blot 測定小鼠皮層中PSD-95 基因在mRNA 和蛋白水平相對表達量。 由圖4a、4b 所示，補充芝麻素， 顯著增加了APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1 區(qū)及皮層中PSD-95 mRNA 表達 （P<0.05）。 圖4c 所示，4 組小鼠皮層中的PSD-95 蛋白表達之間沒有顯著性差異（P>0.05）。 綜上所述，芝麻素能改善由阿爾茲海默癥造成的突觸功能障礙。

圖4 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬病理學(xué)變化和PSD-95 水平的影響Fig.4 Effects of sesamin on histopathological changes and the PSD-95 levels in the cortex of APP/PS1 transgenic mice

2.4 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ 積累的影響

采用硫磺素S 染色和免疫熒光觀察小鼠海馬CA1 區(qū)Aβ 和Aβ1-42 的積累與分布情況，結(jié)果如圖4a 所示。 對熒光染色圖中Aβ 的熒光強度進行定量分析，如圖4b 和4c 所示，AD 組與AD+SE 組的Aβ 積累有顯著差異（P<0.01），表明芝麻素能顯著降低APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1 區(qū)Aβ 的積累。 通過RT-PCR 探究小鼠皮層中基因APP 在mRNA 水平的表達情況。由圖4d 所示，AD 組小鼠皮層中的APP 在mRNA 水平相對含量顯著高于WT 組小鼠（P<0.01），而膳食補充芝麻素后小鼠皮層中APP 在mRNA 水平的相對含量顯著降低（P<0.05）。綜上所述，芝麻素可抑制小鼠腦內(nèi)Aβ 的積累。

圖5 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ 和Aβ1-42 水平的影響Fig.5 Effects of Sesamin on Aβ and Aβ1-42 levels in the brain of APP/PS1 transgenic mice

2.5 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的影響

據(jù)報道，神經(jīng)炎癥是AD 潛在的風(fēng)險因素。 由圖6a 和圖6b 所示， 采用免疫組化觀察小鼠海馬中IBA-1 的表達與分布情況并進行定量分析，結(jié)果顯示， 對AD 模型小鼠補充芝麻素能夠顯著減少IBA-1 在免疫組化中陽性細(xì)胞數(shù)目（P<0.05）。通過RT-PCR 探究小鼠腦皮層中炎癥相關(guān)基因表達情況， 結(jié)果如圖6c 和圖6d 所示， 與WT 組相比，AD 對照組小鼠皮層中的炎癥相關(guān)基因IL-1β（P<0.01）和IBA-1（P<0.05）mRNA 相對含量顯著增高，而膳食補充芝麻素顯著抑制了IL-1β 和IBA-1 的表達（P<0.01）。 綜上，補充芝麻素能夠顯著降低APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥。

2.6 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦部AKTPI3K 信號通路的調(diào)節(jié)作用

IDE 在腦部通過水解Aβ，減少Aβ 的積累，從而減少阿爾茲海默癥對大腦的影響。 胰島素通路AKT-PI3K 已被證明與AD 的可能病因相關(guān)[5]。 通過Western blot 試驗對以上假設(shè)進行探究。 圖7a為Western blot 代表性圖像。 如圖7b、7c 和7d 所示，補充芝麻素使淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、 蛋白激酶B （protein kinase B，AKT）、IDE 蛋白相對表達量顯著提升（P<0.05）。同樣，如圖7e 所示，基因IDE 在mRNA 的相對含量得到提升（P<0.01）。 綜上所述，芝麻素激活了AKT-PI3K 信號通路， 且提高了IDE 在mRNA 水平及蛋白的相對表達。

圖6 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦部神經(jīng)炎癥的影響Fig.6 Effects of sesamin on neuroinflammation in APP/PS1 transgenic mice brain

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)芝麻素膳食補充可以改善APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知障礙。 此外，芝麻素還改善了由APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠大腦的神經(jīng)系統(tǒng)損害并增強了突觸可塑性。 芝麻素通過降低小鼠大腦皮層中Aβ 的積累， 下調(diào)大腦皮層中炎癥相關(guān)基因IBA-1 和IL-1β 的相對含量。 芝麻素激活了AKT并且上調(diào)IDE 基因和蛋白表達。

芝麻素的主要代謝過程為攝入后被腸吸收，然后在體內(nèi)進一步代謝轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚衍生物，并在肝臟中進一步轉(zhuǎn)化為其葡萄糖醛酸或硫酸鹽；此外，芝麻素自身可以通過全身循環(huán)后穿過血腦屏障[18-20]。 根據(jù)作者之前的研究，口服芝麻素治療（50 mg/kg/d bw）可通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor， BDNF）表達來顯著改善慢性和不可預(yù)測的輕度壓力抑郁，如焦慮、 壓力誘發(fā)的行為和心理障礙并改善突觸功能[6-7]。 本試驗中小鼠食用的芝麻素劑量（50 mg/kg）轉(zhuǎn)化為人用的劑量為5.5 mg/kg，根據(jù)之前的文獻報道，該劑量在安全劑量之內(nèi)[21]。 在后續(xù)試驗中可以考慮采用在安全范圍的更高劑量探究是否有更明顯的神經(jīng)保護和改善認(rèn)知作用。 本研究與之前的研究一致， 膳食補充芝麻素可減緩神經(jīng)退行性變化中的認(rèn)知功能障礙。

阿爾茲海默癥最主要的一個病理學(xué)特征是Aβ 在大腦中過度積累。 Aβ 是一種含有39～43 個氨基酸的肽， 由APP 通過β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用產(chǎn)生。 它可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生， 并在血液、腦脊髓液和腦組織液中循環(huán)。 本研究中，雖然Aβ 聚集被芝麻素減少， 但有意思的是，APP 的表達被上調(diào)了， 對這一結(jié)果推測可能是裂解酶活性受到抑制，無法繼續(xù)分解為Aβ，這需要在后續(xù)試驗中繼續(xù)檢測這些相關(guān)酶的表達和活力。 在機體腦部中，IDE 能夠通過水解Aβ 的方式，來減少Aβ的積累。有研究報道，在認(rèn)知缺陷模型中通過激活蛋白激酶B（AKT）可增加IDE 的表達，對Aβ 發(fā)揮清除作用，從而起到神經(jīng)保護作用[22]。 同樣的，本研究顯示，AKT 蛋白表達與IDE 基因和蛋白能被芝麻素上調(diào)（圖7c～7e），同時芝麻素膳食補充能減少Aβ 的聚集（圖5）有關(guān)。 然而，芝麻素如何激活A(yù)KT 信號通路， 是否與其改善胰島素敏感性的生物活性相關(guān)，尚不清楚，需進一步研究。

圖7 芝麻素對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠皮層APP、p-AKT 和IDE 蛋白表達的影響Fig.7 Effects of sesamin on the protein expression of APP， p-AKT and IDE in APP/PS1 transgenic mice cortex

神經(jīng)炎癥為神經(jīng)退行性疾病的重要因素之一， 研究表明， 神經(jīng)炎癥會破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能， 造成突觸功能障礙及誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對大腦的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能也會造成損傷，通過抑制神經(jīng)炎癥可以達到緩解神經(jīng)退行性疾病的目的[23]。 先前研究表明，芝麻素可以通過激活核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）抑制人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[24]。芝麻素還可以通過激活蛋白激酶B（AKT）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）來增強Nrf2介導(dǎo)的結(jié)腸炎保護作用[25]。 此外，在人體以及動物試驗中也報道了芝麻素具有一定的抗炎作用[24-26]。在一項糖尿病視網(wǎng)膜病變的動物研究中發(fā)現(xiàn)，芝麻素作為膳食補充劑可以降低視網(wǎng)膜上小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-1 的表達[26]。而在本研究中，芝麻素同樣顯著抑制了小鼠大腦IBA-1 過度激活和IL-1β 在mRNA 水平的相對表達量（圖6），這與先前的報道一致。 后續(xù)將探究芝麻素抑制神經(jīng)炎癥的具體分子機制。

綜上， 膳食補充芝麻素增加了APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦部突觸功能相關(guān)蛋白表達， 減少了Aβ積累，改善了認(rèn)知障礙。芝麻素的神經(jīng)保護作用可能依賴于其抑制神經(jīng)炎癥并激活A(yù)KT/IDE 途徑。本研究結(jié)果為芝麻素這種具有神經(jīng)保護作用的食品功能組分在腦健康領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。