長期穩(wěn)定的SD 大鼠2 型糖尿病模型制備方法

黎婭，范培云，馬曉雨，常秀君，何敏，韓蕙竹，粟尹，夏曉曉，韋秀萍，吳穹*

(1. 青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001； 2. 青海省人民醫(yī)院內(nèi)分泌2 科，西寧 810007； 3. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001； 4. 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637002)

糖尿病的流行，已成為世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。 國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)預(yù)測到2045 年全球糖尿病患者將達(dá)6.93 億[1]。 2 型糖尿病作為糖尿病的一個(gè)龐大分支，約占糖尿病總數(shù)90%[2]。因此，臨床相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動物模型建立，對2 型糖尿病研究具有重要意義。 研究表明，高脂飲食(high fat diet，HFD)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制備的2 型糖尿病大鼠模型能夠較好地模擬人類2 型糖尿病發(fā)病過程[3-4]。 但這一造模方法尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各研究中所用的高脂飼料種類、喂養(yǎng)時(shí)間、STZ 劑量及注射方式并不完全一致。 本實(shí)驗(yàn)通過HFD 聯(lián)合小劑量STZ 建立2 型糖尿病大鼠模型，并進(jìn)一步觀察模型的穩(wěn)定性及相關(guān)指標(biāo)變化，旨在構(gòu)建一種理想的2 型糖尿病動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30 只，4周齡，體重80 ～100 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號【SCXK(陜)2017-003】。 兩只每籠喂養(yǎng)，室溫(22 ± 2)℃，相對濕度65% ～75%，每天12 h 光照，12 h 黑暗循環(huán)，自由飲水、攝食，動物飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物房【SYXK(青)2019-0001】，并由青海大學(xué)倫理委員會開具了小動物實(shí)驗(yàn)的倫理證明及允許使用證明。

1.1.2 儀器與試劑

STZ(Sigma 公司，美國)；檸檬酸鈉無菌緩沖液(Solarbio 公司，北京)；門冬胰島素注射液(Novo Nordisk，丹麥)、50%葡萄糖溶液(青海省人民醫(yī)院，青海)；卓越金采血糖儀及試紙(Roche 公司，美國)。 高脂飼料(基礎(chǔ)飼料上加10%蔗糖、10%豬油、1%膽固醇、0.3%膽酸鈉)。 STZ 溶液配制方法：將STZ 溶解于0.1 mol/L(pH 4.5)檸檬酸鈉無菌緩沖液，配制成2%的STZ 溶液。 由于STZ 溶液不穩(wěn)定，需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好的溶液避光冰浴，30 min 內(nèi)注射完畢。

1.2 方法

1.2.1 2 型糖尿病動物模型建立

大鼠適應(yīng)環(huán)境72 h 后按體重隨機(jī)分為2 組：正常對照組(NG)10 只、2 型糖尿病組(DM)20 只。NG 組給予普通飼料喂養(yǎng)，DM 組給予高脂飼料喂養(yǎng)。 喂養(yǎng)12 周后，DM 組給予新鮮配制2%STZ 溶液尾靜脈注射25 mg/kg，正常對照組給予等劑量檸檬酸鈉無菌緩沖液尾靜脈注射，注射后3 d、7 d 取尾靜脈血測血糖，以7 d 血糖水平≥16.7 mmol/L 為成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 大鼠的一般情況

每天觀察大鼠的精神狀況、毛發(fā)光澤、墊料潮濕程度，記錄大鼠的進(jìn)食量、飲水量。 每周稱取大鼠體重，于實(shí)驗(yàn)開始、高脂第12 周、以及造模成功后每周測量血糖。

1.2.3 口服糖耐量(OGTT)及胰島素耐量試驗(yàn)(IPITT)

各組大鼠喂養(yǎng)第12 周，進(jìn)行OGTT 及IPITT 試驗(yàn)。 在OGTT 試驗(yàn)中，大鼠禁食12 h 后，灌胃給予50%的葡萄糖溶液2 g/kg，尾靜脈檢測0 min 及葡萄糖灌胃后30、60、90、120 min 的血糖，并計(jì)算曲線下面積(AUC)[5]。間隔48 h 后，進(jìn)行IPITT 試驗(yàn)，大鼠禁食6 h，于腹腔注射0.5 u/kg 的門冬胰島素溶液，尾靜脈檢測0 min 及注射后15、30、60、90、120 min的血糖，并計(jì)算曲線下面積(AUC)[5]。

1.2.4 果糖胺測定

實(shí)驗(yàn)第20 周，所有大鼠隔夜禁食12 h，稱取體重后，麻醉大鼠，腹主動脈取血送檢，于青海省人民醫(yī)院檢測大鼠血清果糖胺(fructosamine，F(xiàn)RA)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS25.0 和Prism 7 圖像分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察結(jié)果

兩組大鼠在STZ 干預(yù)前攝食、飲水、尿量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 STZ 干預(yù)后，NG 組大鼠精神狀況良好，反應(yīng)靈敏，動作自如，雙目有神，毛發(fā)平伏有光澤，墊料干燥，進(jìn)食量、飲水量較前無明顯變化。 DM 組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛豎無光澤，倦怠懶動，墊料潮濕，進(jìn)食量、飲水量顯著增加(P＜0.05)，見表1。

2.2 體重變化

STZ 干預(yù)前，兩組大鼠體重隨周齡增加而增加，DM 組體重增幅略高于NG 組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在12 周末DM 組顯著高于NG 組(P＜0.05)(圖1A)。 STZ 干預(yù)后DM 組體重呈下降趨勢，差異具有顯著性(P＜0.05)，但從第6 周開始，下降幅度逐漸減??；而NG 組體重隨著周齡仍然逐漸增加，但增幅較之前有所下降(圖1B)。

2.3 OGTT 及IPITT

如圖2A 所示，OGTT 試驗(yàn)表明，給予葡萄糖負(fù)荷后，NG 組30 min 后血糖升至最高，而DM 組血糖高峰延遲至60 min，且葡萄糖清除率總體上出現(xiàn)延遲，在60、90、120 min 血糖明顯高于NG 組(P＜0.05)；DM 組曲線下面積增大，差異具有顯著性(P＜0.05)。 相應(yīng)的，IPITT 試驗(yàn)表明(圖2B)，注射胰島素兩組大鼠血糖在15 min 及30 min 快速下降，于60 min 后血糖達(dá)到最低點(diǎn)，但DM 組血糖總體仍高于NG 組(P＜0.05)；DM 組曲線下面積增大，差異具有顯著性(P＜0.05)，提示DM 組大鼠的胰島素敏感性下降。 這些結(jié)果都反應(yīng)了DM 大鼠存在胰島素抵抗。

表1 大鼠24 h 攝食量及飲水量比較(±s)Table 1 Comparison of 24 h food intake and water consumption of rats(±s)

表1 大鼠24 h 攝食量及飲水量比較(±s)Table 1 Comparison of 24 h food intake and water consumption of rats(±s)

注：與NG 組比較，*P＜0.05。 (下圖同)Note. Compared with NG group，*P＜0.05.(The same in the following Figures)

注射STZ 前Before STZ injection注射STZ4 周后4 weeks after STZ injection注射STZ8 周后8 weeks after STZ injection組別Groups 24 h 攝食量(g)24 h food-intake(g)24 h 飲水量(mL)24 h drinking(mL)24 h 攝食量(g)24 h food-intake(g)24 飲水量(mL)24 h drinking(mL)24 h 攝食量(g)24 h food-intake(g)24 飲水量(mL)24 h drinking(mL)正常對照組NG 25.8 ± 1.9 50.0 ± 2.5 27.2 ± 2.1 50.4 ± 2.2 26.6 ± 2.2 49.4 ± 1.7 2 型糖尿病組DM 28.2 ± 2.5 55.5 ± 2.2 40.2 ± 3.3* 176.5 ± 11.0* 40.7 ± 2.7* 197.5 ± 13.6*

圖1 STZ 干預(yù)前(A)與STZ 干預(yù)后(B)兩組體重變化比較(±s)Figure 1 Comparison of changes in body weight between the two groups before STZ intervention (A) and after STZ intervention (B)(±s)

2.4 隨機(jī)血糖及果糖胺水平

兩組大鼠在STZ 干預(yù)前隨機(jī)血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 STZ 干預(yù)后1～8 周，DM 組血糖明顯高于NG 組(P＜0.05)，并于STZ 注射3 周末逐漸趨于穩(wěn)定(圖3A)。 如圖3B 所示，與NG 組比較，DM 組果糖胺含量明顯升高(P＜0.05)。

2.5 成膜率與死亡率

在給予STZ 第2 周，DM 組均出現(xiàn)明顯的“三多一少” 癥狀，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，成模率100%。 在給予STZ 第8 周，不給于任何降糖治療情況下，DM 組死亡5 只，死亡率25%。

3 討論

圖2 兩組糖耐量試驗(yàn)(A)與胰島素耐量試驗(yàn)(B)比較(±s)Figure 2 Comparison of OGTT (A) and IPITT (B) between the two groups(±s)

圖3 兩組隨機(jī)血糖(A)及果糖胺(B)比較(±s)Figure 3 Comparison of random blood glucose and fructosamine between the two groups(±s)

2 型糖尿病是一種復(fù)雜的慢性代謝性疾病，以高血糖、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和胰島素缺乏為主要特征。 IR 是2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)，存在IR 的患者往往在患病的初期會經(jīng)歷糖尿病和正常血糖之間的一種特殊代謝狀態(tài)，包括糖耐量減低和(或)空腹血糖調(diào)節(jié)受損[6]，臨床上稱為糖尿病前期。 研究表明高脂飲食能夠降低實(shí)驗(yàn)動物的胰島素敏感性，誘發(fā)胰島素抵抗[7-8]，是建立2 型糖尿病模型的重要依據(jù)。 不足的是，在出現(xiàn)明顯的高血糖癥狀前，這種模型需要長期的高脂喂養(yǎng)方案，增加了實(shí)驗(yàn)的耗時(shí)及經(jīng)費(fèi)。使用STZ 很好地克服了這一障礙，在HFD 誘導(dǎo)IR之后，注射小劑量STZ 導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能障礙，實(shí)現(xiàn)了從IR 向2 型糖尿病非?？焖俸头浅Ｗ匀坏倪^度。 在2 型糖尿病早期患者中，β 細(xì)胞功能喪失僅為24%，而在2 型糖尿病晚期，β 細(xì)胞質(zhì)量減少了54%[2]。 STZ 的劑量對大鼠β 細(xì)胞殘存功能有較大的影響，大劑量STZ 誘導(dǎo)更類似于1 型糖尿病的代謝特征，表現(xiàn)為胰島素分泌嚴(yán)重不足，低劑量STZ可能又無法充分誘導(dǎo)2 型糖尿病。 較低劑量的STZ能夠更好地模擬2 型糖尿病中β 細(xì)胞功能的部分喪失[2]。 Mansor 等[9]研究表明高脂喂養(yǎng)2 周聯(lián)合STZ 15、25 mg/kg 腹腔注射為誘導(dǎo)2 型糖尿病的最佳劑量，30 mg/kg 劑量引起明顯和嚴(yán)重的心臟代謝改變，更類似于1 型糖尿病。 但該模型僅維持了一周，血糖的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。 劉丹丹等[10]以高脂喂養(yǎng)6 周聯(lián)合STZ 30 mg/kg 腹腔注射，成模率70%，該模型繼續(xù)維持2 周血糖穩(wěn)定。 邵俊偉等[11]高脂喂養(yǎng)4 周聯(lián)合STZ 35 mg/kg 腹腔注射，成膜率85%，維持10 d。 研究表明，隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長，動物肥胖和胰島素抵抗更加明顯，胰島素的負(fù)荷越重，制備2 型糖尿病動物模型使用的STZ 劑量就越少[12]。 在本研究中，HFD 喂養(yǎng)12 周后，DM 組大鼠葡萄糖清除率總體延遲(圖2A)，胰島素敏感性下降(圖2C)，且體重明顯增加(圖1A)，這些結(jié)果都表明DM 組大鼠存在胰島素抵抗。 尾靜脈注射STZ 25 mg/kg 后，DM 組出現(xiàn)明顯的高血糖(表1)及“三多一少”癥狀(圖2B)，且全部成模。 本實(shí)驗(yàn)中采用尾靜脈注射STZ 表現(xiàn)出比腹腔注射更好的穩(wěn)定性，且血糖升高持續(xù)8 周沒有回落(圖3A)，與Tay 等[13]的研究一致。 與腹腔注射STZ 相比，尾靜脈注射更加直觀，進(jìn)針回抽有血再注射藥物，避免了腹腔注射時(shí)藥物進(jìn)入皮下或腸道，導(dǎo)致死亡率增加或降低糖尿病的原發(fā)病作用。 但尾靜脈注射藥物利用率高，對劑量的準(zhǔn)確性要求較高，研究者如能在前期進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)將大大提高成模率。 STZ 之前高脂飼料喂養(yǎng)12 周，確保大鼠形成IR，IR 的持續(xù)存在不僅符合2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，降低了葡萄糖的利用率，且有利于高血糖的維持。 果糖胺是血漿中各種蛋白質(zhì)與葡萄糖非酶糖化過程中形成的高分子酮胺結(jié)構(gòu)物質(zhì)，它的濃度與血糖水平成正相關(guān)且相對穩(wěn)定。 由于血漿蛋白的半衰期為17 ～20 d，故果糖胺可反映糖尿病患者2 ～3 周總體血糖情況。本研究中DM 組果糖胺明顯升高(圖3B)，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的成功。 到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，模型組死亡5 只，死亡率25%，對照組全部存活。 對死亡大鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)2 只大鼠存在明顯的肺部感染，由于DM 組大鼠多尿墊料潮濕，每天兩次更換，系更換墊料時(shí)吸入碎屑及粉末所致。 2 只腎臟明顯膿腫，推測墊料潮濕導(dǎo)致泌尿系上行感染所致。 另1 只體重下降明顯，弓背倦體，精神萎靡，行動遲緩，系營養(yǎng)不良或酮癥酸中毒所致。

綜上所述，HFD 喂養(yǎng)12 周聯(lián)合STZ 25 mg/kg尾靜脈注射，成功誘導(dǎo)以胰島素抵抗為特征的2 型糖尿病。 該模型成膜率高、血糖穩(wěn)定適合2 型糖尿病相關(guān)藥物及并發(fā)癥研究。 但本研究在造模成功后，采用普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)未能觀察到兩組血脂差異，且在高脂喂養(yǎng)12 周時(shí)，遺憾未能進(jìn)行血脂檢測，如實(shí)驗(yàn)者需進(jìn)行降脂相關(guān)研究，本模型還需進(jìn)一步探討。 2 型糖尿病大鼠模型在長期的喂養(yǎng)過程中，由于高血糖狀態(tài)、機(jī)體抵抗力差等原因仍存在較高的死亡率。 需要研究者在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境清潔，定期消毒殺菌，保持墊料相對干燥的同時(shí)盡量減少更換墊料時(shí)大鼠粉塵吸入。