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    長期穩(wěn)定的SD 大鼠2 型糖尿病模型制備方法

    2020-07-08 15:02:26黎婭范培云馬曉雨常秀君何敏韓蕙竹粟尹夏曉曉韋秀萍吳穹
    關(guān)鍵詞:胰島素血糖糖尿病

    黎婭,范培云,馬曉雨,常秀君,何敏,韓蕙竹,粟尹,夏曉曉,韋秀萍,吳穹*

    (1. 青海大學(xué)附屬醫(yī)院,西寧 810001; 2. 青海省人民醫(yī)院內(nèi)分泌2 科,西寧 810007; 3. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,西寧 810001; 4. 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 南充 637002)

    糖尿病的流行,已成為世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。 國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)預(yù)測到2045 年全球糖尿病患者將達(dá)6.93 億[1]。 2 型糖尿病作為糖尿病的一個(gè)龐大分支,約占糖尿病總數(shù)90%[2]。因此,臨床相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立,對2 型糖尿病研究具有重要意義。 研究表明,高脂飲食(high fat diet,HFD)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制備的2 型糖尿病大鼠模型能夠較好地模擬人類2 型糖尿病發(fā)病過程[3-4]。 但這一造模方法尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),各研究中所用的高脂飼料種類、喂養(yǎng)時(shí)間、STZ 劑量及注射方式并不完全一致。 本實(shí)驗(yàn)通過HFD 聯(lián)合小劑量STZ 建立2 型糖尿病大鼠模型,并進(jìn)一步觀察模型的穩(wěn)定性及相關(guān)指標(biāo)變化,旨在構(gòu)建一種理想的2 型糖尿病動(dòng)物模型。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF 級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30 只,4周齡,體重80 ~100 g,購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號【SCXK(陜)2017-003】。 兩只每籠喂養(yǎng),室溫(22 ± 2)℃,相對濕度65% ~75%,每天12 h 光照,12 h 黑暗循環(huán),自由飲水、攝食,動(dòng)物飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房【SYXK(青)2019-0001】,并由青海大學(xué)倫理委員會(huì)開具了小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理證明及允許使用證明。

    1.1.2 儀器與試劑

    STZ(Sigma 公司,美國);檸檬酸鈉無菌緩沖液(Solarbio 公司,北京);門冬胰島素注射液(Novo Nordisk,丹麥)、50%葡萄糖溶液(青海省人民醫(yī)院,青海);卓越金采血糖儀及試紙(Roche 公司,美國)。 高脂飼料(基礎(chǔ)飼料上加10%蔗糖、10%豬油、1%膽固醇、0.3%膽酸鈉)。 STZ 溶液配制方法:將STZ 溶解于0.1 mol/L(pH 4.5)檸檬酸鈉無菌緩沖液,配制成2%的STZ 溶液。 由于STZ 溶液不穩(wěn)定,需現(xiàn)配現(xiàn)用,配制好的溶液避光冰浴,30 min 內(nèi)注射完畢。

    1.2 方法

    1.2.1 2 型糖尿病動(dòng)物模型建立

    大鼠適應(yīng)環(huán)境72 h 后按體重隨機(jī)分為2 組:正常對照組(NG)10 只、2 型糖尿病組(DM)20 只。NG 組給予普通飼料喂養(yǎng),DM 組給予高脂飼料喂養(yǎng)。 喂養(yǎng)12 周后,DM 組給予新鮮配制2%STZ 溶液尾靜脈注射25 mg/kg,正常對照組給予等劑量檸檬酸鈉無菌緩沖液尾靜脈注射,注射后3 d、7 d 取尾靜脈血測血糖,以7 d 血糖水平≥16.7 mmol/L 為成模標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2.2 大鼠的一般情況

    每天觀察大鼠的精神狀況、毛發(fā)光澤、墊料潮濕程度,記錄大鼠的進(jìn)食量、飲水量。 每周稱取大鼠體重,于實(shí)驗(yàn)開始、高脂第12 周、以及造模成功后每周測量血糖。

    1.2.3 口服糖耐量(OGTT)及胰島素耐量試驗(yàn)(IPITT)

    各組大鼠喂養(yǎng)第12 周,進(jìn)行OGTT 及IPITT 試驗(yàn)。 在OGTT 試驗(yàn)中,大鼠禁食12 h 后,灌胃給予50%的葡萄糖溶液2 g/kg,尾靜脈檢測0 min 及葡萄糖灌胃后30、60、90、120 min 的血糖,并計(jì)算曲線下面積(AUC)[5]。間隔48 h 后,進(jìn)行IPITT 試驗(yàn),大鼠禁食6 h,于腹腔注射0.5 u/kg 的門冬胰島素溶液,尾靜脈檢測0 min 及注射后15、30、60、90、120 min的血糖,并計(jì)算曲線下面積(AUC)[5]。

    1.2.4 果糖胺測定

    實(shí)驗(yàn)第20 周,所有大鼠隔夜禁食12 h,稱取體重后,麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血送檢,于青海省人民醫(yī)院檢測大鼠血清果糖胺(fructosamine,F(xiàn)RA)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS25.0 和Prism 7 圖像分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水平α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況觀察結(jié)果

    兩組大鼠在STZ 干預(yù)前攝食、飲水、尿量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 STZ 干預(yù)后,NG 組大鼠精神狀況良好,反應(yīng)靈敏,動(dòng)作自如,雙目有神,毛發(fā)平伏有光澤,墊料干燥,進(jìn)食量、飲水量較前無明顯變化。 DM 組大鼠精神萎靡,反應(yīng)遲鈍,毛豎無光澤,倦怠懶動(dòng),墊料潮濕,進(jìn)食量、飲水量顯著增加(P<0.05),見表1。

    2.2 體重變化

    STZ 干預(yù)前,兩組大鼠體重隨周齡增加而增加,DM 組體重增幅略高于NG 組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在12 周末DM 組顯著高于NG 組(P<0.05)(圖1A)。 STZ 干預(yù)后DM 組體重呈下降趨勢,差異具有顯著性(P<0.05),但從第6 周開始,下降幅度逐漸減??;而NG 組體重隨著周齡仍然逐漸增加,但增幅較之前有所下降(圖1B)。

    2.3 OGTT 及IPITT

    如圖2A 所示,OGTT 試驗(yàn)表明,給予葡萄糖負(fù)荷后,NG 組30 min 后血糖升至最高,而DM 組血糖高峰延遲至60 min,且葡萄糖清除率總體上出現(xiàn)延遲,在60、90、120 min 血糖明顯高于NG 組(P<0.05);DM 組曲線下面積增大,差異具有顯著性(P<0.05)。 相應(yīng)的,IPITT 試驗(yàn)表明(圖2B),注射胰島素兩組大鼠血糖在15 min 及30 min 快速下降,于60 min 后血糖達(dá)到最低點(diǎn),但DM 組血糖總體仍高于NG 組(P<0.05);DM 組曲線下面積增大,差異具有顯著性(P<0.05),提示DM 組大鼠的胰島素敏感性下降。 這些結(jié)果都反應(yīng)了DM 大鼠存在胰島素抵抗。

    表1 大鼠24 h 攝食量及飲水量比較(±s)Table 1 Comparison of 24 h food intake and water consumption of rats(±s)

    表1 大鼠24 h 攝食量及飲水量比較(±s)Table 1 Comparison of 24 h food intake and water consumption of rats(±s)

    注:與NG 組比較,*P<0.05。 (下圖同)Note. Compared with NG group,*P<0.05.(The same in the following Figures)

    注射STZ 前Before STZ injection注射STZ4 周后4 weeks after STZ injection注射STZ8 周后8 weeks after STZ injection組別Groups 24 h 攝食量(g)24 h food-intake(g)24 h 飲水量(mL)24 h drinking(mL)24 h 攝食量(g)24 h food-intake(g)24 飲水量(mL)24 h drinking(mL)24 h 攝食量(g)24 h food-intake(g)24 飲水量(mL)24 h drinking(mL)正常對照組NG 25.8 ± 1.9 50.0 ± 2.5 27.2 ± 2.1 50.4 ± 2.2 26.6 ± 2.2 49.4 ± 1.7 2 型糖尿病組DM 28.2 ± 2.5 55.5 ± 2.2 40.2 ± 3.3* 176.5 ± 11.0* 40.7 ± 2.7* 197.5 ± 13.6*

    圖1 STZ 干預(yù)前(A)與STZ 干預(yù)后(B)兩組體重變化比較(±s)Figure 1 Comparison of changes in body weight between the two groups before STZ intervention (A) and after STZ intervention (B)(±s)

    2.4 隨機(jī)血糖及果糖胺水平

    兩組大鼠在STZ 干預(yù)前隨機(jī)血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 STZ 干預(yù)后1~8 周,DM 組血糖明顯高于NG 組(P<0.05),并于STZ 注射3 周末逐漸趨于穩(wěn)定(圖3A)。 如圖3B 所示,與NG 組比較,DM 組果糖胺含量明顯升高(P<0.05)。

    2.5 成膜率與死亡率

    在給予STZ 第2 周,DM 組均出現(xiàn)明顯的“三多一少” 癥狀,隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L,成模率100%。 在給予STZ 第8 周,不給于任何降糖治療情況下,DM 組死亡5 只,死亡率25%。

    3 討論

    圖2 兩組糖耐量試驗(yàn)(A)與胰島素耐量試驗(yàn)(B)比較(±s)Figure 2 Comparison of OGTT (A) and IPITT (B) between the two groups(±s)

    圖3 兩組隨機(jī)血糖(A)及果糖胺(B)比較(±s)Figure 3 Comparison of random blood glucose and fructosamine between the two groups(±s)

    2 型糖尿病是一種復(fù)雜的慢性代謝性疾病,以高血糖、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和胰島素缺乏為主要特征。 IR 是2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ),存在IR 的患者往往在患病的初期會(huì)經(jīng)歷糖尿病和正常血糖之間的一種特殊代謝狀態(tài),包括糖耐量減低和(或)空腹血糖調(diào)節(jié)受損[6],臨床上稱為糖尿病前期。 研究表明高脂飲食能夠降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰島素敏感性,誘發(fā)胰島素抵抗[7-8],是建立2 型糖尿病模型的重要依據(jù)。 不足的是,在出現(xiàn)明顯的高血糖癥狀前,這種模型需要長期的高脂喂養(yǎng)方案,增加了實(shí)驗(yàn)的耗時(shí)及經(jīng)費(fèi)。使用STZ 很好地克服了這一障礙,在HFD 誘導(dǎo)IR之后,注射小劑量STZ 導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能障礙,實(shí)現(xiàn)了從IR 向2 型糖尿病非??焖俸头浅W匀坏倪^度。 在2 型糖尿病早期患者中,β 細(xì)胞功能喪失僅為24%,而在2 型糖尿病晚期,β 細(xì)胞質(zhì)量減少了54%[2]。 STZ 的劑量對大鼠β 細(xì)胞殘存功能有較大的影響,大劑量STZ 誘導(dǎo)更類似于1 型糖尿病的代謝特征,表現(xiàn)為胰島素分泌嚴(yán)重不足,低劑量STZ可能又無法充分誘導(dǎo)2 型糖尿病。 較低劑量的STZ能夠更好地模擬2 型糖尿病中β 細(xì)胞功能的部分喪失[2]。 Mansor 等[9]研究表明高脂喂養(yǎng)2 周聯(lián)合STZ 15、25 mg/kg 腹腔注射為誘導(dǎo)2 型糖尿病的最佳劑量,30 mg/kg 劑量引起明顯和嚴(yán)重的心臟代謝改變,更類似于1 型糖尿病。 但該模型僅維持了一周,血糖的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。 劉丹丹等[10]以高脂喂養(yǎng)6 周聯(lián)合STZ 30 mg/kg 腹腔注射,成模率70%,該模型繼續(xù)維持2 周血糖穩(wěn)定。 邵俊偉等[11]高脂喂養(yǎng)4 周聯(lián)合STZ 35 mg/kg 腹腔注射,成膜率85%,維持10 d。 研究表明,隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長,動(dòng)物肥胖和胰島素抵抗更加明顯,胰島素的負(fù)荷越重,制備2 型糖尿病動(dòng)物模型使用的STZ 劑量就越少[12]。 在本研究中,HFD 喂養(yǎng)12 周后,DM 組大鼠葡萄糖清除率總體延遲(圖2A),胰島素敏感性下降(圖2C),且體重明顯增加(圖1A),這些結(jié)果都表明DM 組大鼠存在胰島素抵抗。 尾靜脈注射STZ 25 mg/kg 后,DM 組出現(xiàn)明顯的高血糖(表1)及“三多一少”癥狀(圖2B),且全部成模。 本實(shí)驗(yàn)中采用尾靜脈注射STZ 表現(xiàn)出比腹腔注射更好的穩(wěn)定性,且血糖升高持續(xù)8 周沒有回落(圖3A),與Tay 等[13]的研究一致。 與腹腔注射STZ 相比,尾靜脈注射更加直觀,進(jìn)針回抽有血再注射藥物,避免了腹腔注射時(shí)藥物進(jìn)入皮下或腸道,導(dǎo)致死亡率增加或降低糖尿病的原發(fā)病作用。 但尾靜脈注射藥物利用率高,對劑量的準(zhǔn)確性要求較高,研究者如能在前期進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)將大大提高成模率。 STZ 之前高脂飼料喂養(yǎng)12 周,確保大鼠形成IR,IR 的持續(xù)存在不僅符合2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展,降低了葡萄糖的利用率,且有利于高血糖的維持。 果糖胺是血漿中各種蛋白質(zhì)與葡萄糖非酶糖化過程中形成的高分子酮胺結(jié)構(gòu)物質(zhì),它的濃度與血糖水平成正相關(guān)且相對穩(wěn)定。 由于血漿蛋白的半衰期為17 ~20 d,故果糖胺可反映糖尿病患者2 ~3 周總體血糖情況。本研究中DM 組果糖胺明顯升高(圖3B),進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的成功。 到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí),模型組死亡5 只,死亡率25%,對照組全部存活。 對死亡大鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)2 只大鼠存在明顯的肺部感染,由于DM 組大鼠多尿墊料潮濕,每天兩次更換,系更換墊料時(shí)吸入碎屑及粉末所致。 2 只腎臟明顯膿腫,推測墊料潮濕導(dǎo)致泌尿系上行感染所致。 另1 只體重下降明顯,弓背倦體,精神萎靡,行動(dòng)遲緩,系營養(yǎng)不良或酮癥酸中毒所致。

    綜上所述,HFD 喂養(yǎng)12 周聯(lián)合STZ 25 mg/kg尾靜脈注射,成功誘導(dǎo)以胰島素抵抗為特征的2 型糖尿病。 該模型成膜率高、血糖穩(wěn)定適合2 型糖尿病相關(guān)藥物及并發(fā)癥研究。 但本研究在造模成功后,采用普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng),在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)未能觀察到兩組血脂差異,且在高脂喂養(yǎng)12 周時(shí),遺憾未能進(jìn)行血脂檢測,如實(shí)驗(yàn)者需進(jìn)行降脂相關(guān)研究,本模型還需進(jìn)一步探討。 2 型糖尿病大鼠模型在長期的喂養(yǎng)過程中,由于高血糖狀態(tài)、機(jī)體抵抗力差等原因仍存在較高的死亡率。 需要研究者在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境清潔,定期消毒殺菌,保持墊料相對干燥的同時(shí)盡量減少更換墊料時(shí)大鼠粉塵吸入。

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