DHA 對(duì)高脂食物誘導(dǎo)體重增加的保護(hù)作用的研究

張欣，楊英，安曉羽，2，谷艷琪，張引，麻炎，孫利婷，林芳，武強(qiáng)強(qiáng)，2，王亞娜，2，楊慧娣*

肥胖已成為世界范圍內(nèi)一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題[1]。 全球趨勢(shì)顯示，肥胖癥在所有年齡組中的流行率都在上升。 肥胖的特點(diǎn)是白色脂肪組織過(guò)度積累，并與代謝疾病發(fā)生有關(guān)。 肥胖會(huì)導(dǎo)致脂肪組織發(fā)生低度炎癥，并且可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，如，胰島素抵抗和II 型糖尿病[2]。 大量的研究表明，肥胖時(shí)，促炎癥細(xì)胞因子的分泌增加，如白細(xì)胞介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，和瘦素(Leptin)。 而抗炎因子的分泌減少，如脂聯(lián)素(adiponectin)和白介素10(IL-10)[1]。 目前n-3 長(zhǎng)鏈脂肪酸得到廣泛的關(guān)注，許多研究表明n-3 長(zhǎng)鏈脂肪酸(n-3 LC PUFA)，對(duì)健康非常有益，特別是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)對(duì)肥胖和肥胖相關(guān)疾病的發(fā)展有預(yù)防作用[3]。 此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明n-3 LC PUFA 能夠改善肥胖人群的脂肪細(xì)胞的代謝和脂肪因子的分泌特征[3]。 脂肪生成是前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程。脂肪分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要由兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控，CCAAT/enhancer-binding proteins (C/EBPs) 和peroxisome proliferator-activated receptorγ(PPARγ)，維持終末脂肪細(xì)胞分化的兩種主轉(zhuǎn)錄因子。 它們協(xié)同激活可以表達(dá)產(chǎn)生脂肪細(xì)胞表型的基因。 此外，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的激活對(duì)脂肪的積聚也非常重要。 體內(nèi)研究表明，EPA 和DHA 能減少脂肪積累，增加脂肪基因在大鼠[4]、草魚(yú)[5](Ctenopharyngodon idella)脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)。 此外，一些研究表明DHA 對(duì)脂肪細(xì)胞分化和前脂肪細(xì)胞凋亡的沒(méi)有任何作用[1]。 因此，DHA 對(duì)脂肪分化因子的作用仍然很矛盾。

脂肪組織主要包含兩種形式，白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)[1]。 WAT 是主要的能量?jī)?chǔ)存器官，以甘油三酯(triglycerides，TG)的形式積累過(guò)剩的能量。 BAT 的作用主要是有產(chǎn)熱功能，BAT 含有豐富的線粒體，線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白 1(uncoupling protein 1，UCP1)含量比較豐富，UCP1能夠運(yùn)輸質(zhì)子跨過(guò)線粒體內(nèi)膜進(jìn)而破壞氧化磷酸化，這樣就造成了原本用于ATP 合成的能量通過(guò)熱能的形式而散失，所以認(rèn)為BAT 對(duì)于肥胖的防治起著關(guān)鍵的作用[5]。 其中UCP1 是BAT 產(chǎn)熱的一個(gè)重要的標(biāo)記蛋白。 PR 鋅指區(qū)域蛋白16(PR domain containing 16，Prdm16)在細(xì)胞命運(yùn)決定過(guò)程中起著重要作用，促進(jìn)褐色脂肪細(xì)胞的發(fā)育。 Prdm16 可以誘導(dǎo)白色脂肪組織細(xì)胞的褐色化，Prdm16 通過(guò)與PPAR γ 輔助激活物1α(PGC1α)和PPARγ 結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄功能，促進(jìn)褐色脂肪的發(fā)生[6]。 然而，n-3 LC PUFA 對(duì)WAT 和BAT 脂肪分化因子和產(chǎn)熱蛋白影響的證據(jù)還很少。 本研究旨在于探討DHA在肥胖小鼠的WAT 和BAT 中脂肪分化因子的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

32 只雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，體重14 ～16 g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】，飼養(yǎng)在蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(蒙)2014-0002】。 在溫度為(23 ±1)℃，光照為12L：12D(Light：Dark，12 h：12 h)的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。 動(dòng)物進(jìn)行單籠(30 cm × 15 cm × 20 cm)，飼養(yǎng)適應(yīng)1 周。 分別飼以含10% kal 普通對(duì)照食物(100 g 食物中含2 g 豬油和2.5 g 大豆油，20 g 蛋白質(zhì)，70 g 碳水化合物，5.5 g 微量元素，Research Diets，Inc。 貨號(hào)D12450K)和45% kcal 食物(100 g 食物中含20.68 g 豬油和2.91 g 大豆油，20 g 蛋白質(zhì)，50.91 g 碳水化合物，5.5 g 微量元素，Research Diets，Inc。 貨號(hào)D12451)以及45% kcal 加DHA 食物，自由取食和飲水。 所有實(shí)驗(yàn)操作遵循內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物使用相關(guān)倫理要求【YKD2019142】。所有實(shí)驗(yàn)在內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

動(dòng)物分成4 組：飼喂45% kcl 食物的C57BL/6小鼠(n=8)(C57BL/6H)，飼喂10% kcal 食物的C57BL/6 小鼠(n=8)(C57BL/6C)，飼喂45% kcal加DHA 食物(食物中加藻油，每260 毫克含50 毫克的DHA)(n=8)(FADC)或加DHA 食物(食物中加藻油，每260 毫克含100 毫克的DHA) (n= 8)(FADH)，共飼養(yǎng)20 周，處死動(dòng)物后取血液、兩側(cè)肩胛間全部的褐色脂肪組織和腹腔內(nèi)所有脂肪。

1.1.2 主要的試劑和儀器

電子天平(賽多利斯公司)離心機(jī)(Eppendorf)，代謝儀(FOXBOX，Sable Systems International Inc，Las Vegas，NV，USA)，微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific Nano Drop 2000c)，PCR 儀(ABI Veriti 96 well Thermal Cycler)，實(shí)時(shí)定量PCR 儀(ABI7500)。

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(貨號(hào)RR047 A，TaKaRa公司，Japan)、RNAase free H2O、RNAiso Plus Total kit(貨號(hào)9109，TaKaRa 公司，Japan)。

1.2 方法

1.2.1 體重和攝食

每天8：00 - 9：00 用電子天平稱量動(dòng)物的體重(精確到0.1 g)。 食物攝入采用食物平衡法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始稱量動(dòng)物體重，定時(shí)、定量放入足夠的飼料塊。 3 d 后于相同時(shí)間(上午08：00 - 09：00)稱量食物重量。 食物用電子天平稱重(精確到0.001 g)。 72 h 平均食物攝入=(提供的食物- 剩余食物)/3。

1.2.2 靜止代謝率(resting metabolic rate，RMR)的測(cè)定

采用開(kāi)放式代謝儀進(jìn)行測(cè)定。 在第37 周測(cè)定RMR。 小鼠RMR 測(cè)定溫度為(30 ± 0.5)℃[熱中性溫度區(qū)(27.5 ～32.5)℃]，動(dòng)物在測(cè)定代謝率前并不禁食，在呼吸室內(nèi)進(jìn)行代謝率測(cè)定期間(約2 h)無(wú)飲水和食物的供應(yīng)。 這時(shí)測(cè)得的代謝率被稱為靜止代謝率(RMR)。 測(cè)定時(shí)將動(dòng)物放入呼吸室(1.4 L)[采用生化培養(yǎng)箱控溫在(30 ± 0.5)℃]測(cè)定2 h。 測(cè)定前后均進(jìn)行空氣Baseline 測(cè)定。 采用公式：

(FR=空氣流速(mL/min)，F(xiàn)i=進(jìn)入呼吸室之前的空氣含量(%)，F(xiàn)e=從呼吸室流出的空氣含量(%)) ( http：/ /warthog. ucr. edu/WartHogPage/respirometry.html) 計(jì)算RMR。 取值時(shí)，取30 個(gè)連續(xù)穩(wěn)定的最低值的平均值(5 min)作為RMR 的值。 測(cè)定前后均稱量動(dòng)物的體重(電子天平稱量，感量0.1克)。

1.2.3 胰島素、瘦素(Leptin)和甘油三脂(TG)測(cè)定

胰島素(貨號(hào)10-1132-01，Mercodia 公司，Sweden)、瘦素(貨號(hào)ab100718，Abcam，USA)和甘油三脂(TG)(貨號(hào)226900，Abcam 公司，USA)用小鼠ELISA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定，詳細(xì)的操作步驟參照ELISA 試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 采用分光光度計(jì)讀數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)換算成樣品血清胰島素、瘦素和甘油三酯的濃度。

1.2.4 熒光定量PCR

RNAiso Plus Total kit(Takara，Japan)提取白色脂肪和褐色脂肪的總RNA，反轉(zhuǎn)合成cDNA，PCR 使用PrimeScript RT Reagent 試劑盒(Takara)擴(kuò)增引物(見(jiàn)表1)。 定量PCR 擴(kuò)增在Stratagene 定量PCR 儀(Stratagene，USA) 上進(jìn)行。 PCR 的反應(yīng)體系為：6.25 μL 2 × SYBR? Premix EX TaqTMmaster mix(Cat. NO. DRR041D，TaKaRa，Japan)，1 μL cDNA 模板和0.2 μmoL/L 引物。 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃10 s；95℃5 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法檢測(cè)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中分析各基因表達(dá)的相對(duì)差異。 ΔΔCt 值由以下公式得到：ΔΔCt=(Ct靶基因-CtGAPDH)處理組-(Ct靶基因-CtGAPDH)對(duì)照組。 靶基因表達(dá)水平的變化有下面公式求出：靶基因表達(dá)水平差異倍數(shù)=2-ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析之前，使用Kolmogorov-Smirnov and Levene tests 檢測(cè)數(shù)據(jù)的齊性和正態(tài)分布。 所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。體重和攝食和貯存食物量采用重復(fù)測(cè)量(repeated measurement analysis)，顯著差異進(jìn)一步采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，組間比較采用Turkey HSD 分析。 RMR、脂肪、甘油三酯、胰島素、Leptin、PPARγ、PPARα、CEBPα、SREBP1c、Prdm16、UCP1、PGC1α 采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，組間比較采用Turkey HSD 分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重、食物攝入量和靜止代謝率(RMR)以及甘油三脂(TG)和瘦素(Leptin)的測(cè)量

經(jīng)過(guò)食物處理后，C57BL/6 H 組的體重比其他3 組小鼠的體重明顯增加(P＜0.01)，而FAD3H 的體重與C57BL/6C 的體重沒(méi)有差異。 食物攝取在四組間沒(méi)有差異。 C57BL/6 H 組脂肪組織的重量顯著高于其他3 組(P＜0.01)，F(xiàn)AD3 H 組的脂肪重量顯著低于FAD3C 和C57BL/6H，(P＜0.05)，但是與C57BL/6 C 組沒(méi)有明顯差異。 這些數(shù)據(jù)表明45%的高脂食物誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠體重和體脂增加，DHA降低高脂食物誘導(dǎo)的C57BL/6 小鼠的體重和體脂的增加。 為了檢測(cè)能量消耗，測(cè)定了各組的靜止代謝率。 C57BL/6 H 組的靜止代謝率顯著降低，F(xiàn)AD3 H 組的代謝率最高(P＜0.05)(表2)。 這些結(jié)果暗示DHA 可以通過(guò)增加FAD3 H 組的靜止代謝率，增加能量支出，從而降低高脂食物誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠的體重和體脂。

肝臟甘油三脂濃度C57BL/6 H 組最高，F(xiàn)AD3H甘油三脂濃度最低(P＜0.05)。 與其他組相比，C57BL/6 H 組的瘦素的含量明顯增多(P＜0.05)，其他三組之間無(wú)差異。 (表2)

2.2 白 色 組 織 中 UCP1，PGC1α，PRDM16，PPARα，PPARγ，SREBP1c 和CEBPα mRNA 的表達(dá)

在白色組織中，C57BL/6 H 組脂肪分化因子PGC1α、PPARγ、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達(dá)明顯高于其他三組(P＜0.05)，暗示C57BL/6 H組體脂的增加可能與相關(guān)脂肪分化因子的表達(dá)增高有關(guān)；FAD3 H 組PPARγ、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達(dá)明顯低于其他三組(P＜0.05)，說(shuō)明DHA 可以降低這些脂肪分化因子的mRNA 水平，而線粒體生物合成基因PGC1α 的mRNA 表達(dá)顯著低于其他三組(P＜0.05)。 C57BL/6 H 組UCP1 的mRNA 的表達(dá)明顯低于其他三組(P＜0.05)，UCP1是產(chǎn)熱的標(biāo)記蛋白，這一結(jié)果暗示其能量支出減少。 FAD3 C 組和FAD3 H 組的UCP1 的mRNA 的表達(dá)均明顯高于C57BL/6 C 組和C57BL/6 H 組(P＜0.05)。 FAD3 H 組的Prdm16 顯著高于其他三組(P＜0.05)。 PPARα 的表達(dá)4 組無(wú)差異。 (圖1)

2.3 褐 色 組 織 中 UCP1，PGC1α，PRDM16，PPARα，PPARγ，SREBP1c 和CEBPα mRNA 的表達(dá)

在褐色脂肪組織中，C57BL/6 H 組脂肪分化因子PPARγ 的mRNA 的表達(dá)明顯高于其他三組(P＜0.05)；FAD3C 和FAD3H 的PPARγ 的mRNA 的表達(dá)低于C37BL6C(P＜0.05)。 再者，F(xiàn)AD3 C 組和FAD3 H 組SREBP1c 的mRNA 表達(dá)均明顯高于C57BL/6 C組和C57BL/6 H 組(P＜0.05)；C57BL/6 H 組的SREBP1c 的mRNA 最低。 C57BL/6 H 組的Prdm16的mRNA 顯著高于其他三組(P＜0.05)，F(xiàn)AD3 C 組和FAD3 H 組 的 Prdm16 的 mRNA 明 顯 高 于C57BL/6 C 組，但低于C57BL/6 H 組(P＜0.05)，而FAD3 C 組和FAD3 H 組的Prdm16 的mRNA 沒(méi)有差異。 FAD3H 組的PGCLα 的mRNA 表達(dá)最高，C57BL/6 H 組和FAD3 C 組的PGC1α 的mRNA 表達(dá)高于C57BL/6 C 組，但是低于FAD3 H 組(P＜0.05)。 此外，F(xiàn)AD3 H 組UCP1mRNA 表達(dá)明顯高于其他三組(P＜0.05)。 (圖2)

圖1 四組白色脂肪組織中脂肪分化因子和線粒體合成基因的mRNA 的表達(dá)Figure 1 mRNA expression of adipose differentiation factor and mitochondrial synthetic gene of white adipose tissue in four groups

圖2 褐色組織中脂肪分化因子和線粒體合成基因的mRNA 的表達(dá)Figure 2 mRNA expression of adipose differentiation factor and mitochondrial synthetic gene of brown adipose tissue in four groups

3 討論

DHA 作為n-3 LC PUFA 的主要成分之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)和基因表達(dá)的生物活性化合物的結(jié)構(gòu)成分和前體[1-2]。 許多研究表明，DHA 可能影響脂肪積累。 在本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)食物干預(yù)的方法，即飼喂高脂食物和補(bǔ)充DHA 的方法，可降低C57BL/6小鼠高脂食物誘導(dǎo)的體重增加。 研究結(jié)果顯示C57BL/6 小鼠飼喂高脂食物后與體內(nèi)能量積累相關(guān)的指標(biāo)：體重、體脂以及血清甘油三脂和脂肪分泌的瘦素均增加，表明高脂食物誘導(dǎo)了C57BL/6 小鼠的肥胖。 同時(shí)，靜止代謝率顯著降低，說(shuō)明能量支出減少。 然而，C57BL/6 小鼠飼喂高脂食物和DHA 后靜止代謝率明顯增高，暗示C57BL/6 小鼠通過(guò)增加能量支出降低體重。 DHA 影響脂肪形成的一個(gè)重要方法是調(diào)節(jié)脂肪分化因子的表達(dá)。 所以，本實(shí)驗(yàn)研究了DHA 是否通過(guò)抑制脂肪分化因子的表達(dá)來(lái)抑制脂肪積累。

脂肪生成是前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程，脂肪分化因子表達(dá)增加，導(dǎo)致白色脂肪的積累。 PPARγ 和SREBP1c 在脂肪沉積中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[1-3]。 本研究結(jié)果表明在白色組織中，C57BL/6 H 組脂肪分化因子PPARγ、PGC1α、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，表明高脂食物誘導(dǎo)脂肪分化因子表達(dá)。 與對(duì)照組(C57BL/6C)、FAD3 C 組和高脂組(C57BL/6H)相比，F(xiàn)AD3 H 組的PPARγ、PGC1α、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達(dá)顯著降低，說(shuō)明DHA 可以降低脂肪分化因子的表達(dá)，從而減少脂肪積累，而且DHA 的作用具有劑量依賴性。 這與在金色中倉(cāng)鼠中的研究一致[3]，高脂食物飼喂金色中倉(cāng)鼠后PPARγ 和SREBP1c 表達(dá)顯著增加，飼喂高脂食物和n-3 PUFA 后PPARγ 和SREBP1c 表達(dá)顯著降低。

褐色脂肪組織和白色脂肪組織的褐色化可以增加能量支出和產(chǎn)熱。 與褐色脂肪相似，白色脂肪中的褐色細(xì)胞具有較高的線粒體水平，并表達(dá)褐色組織特異性基因，如UCP1 和PGC1α[6-8]。 本研究中飼喂高脂食物和DHA 后，F(xiàn)AD3 C 組和FAD3 H組白色脂肪和褐色脂肪中UCP1 表達(dá)比飼喂高脂食物C57BL/6 H 組顯著增加，暗示DHA 可能通過(guò)增加白色脂肪組織細(xì)胞褐色化和褐色細(xì)胞的產(chǎn)熱，增加能量支出，從而降低體重和體脂。 然而，盡管白色脂肪組織中，高脂食物導(dǎo)致PPARγ 和PGC1α mRNA 的表達(dá)增加，但是Prdm16 mRNA 沒(méi)有任何變化。 但是DHA 卻抑制SREBP1c mRNA 表達(dá)，暗示除了PPARγ 和PGC1α 調(diào)節(jié)UCP1 的表達(dá)以外，SREBP1c 也可能參與了UCP1 表達(dá)的調(diào)節(jié)[9]。 再者，褐色脂肪組織中，高脂食物導(dǎo)致PPARγ 和PGC1α mRNA 的表達(dá)增加，但是UCP1 mRNA 表達(dá)卻沒(méi)有改變，SREBP1c mRNA 表達(dá)被降低，進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)白色脂肪組織中的結(jié)果，暗示SREBP1c 可能在UCP1 表達(dá)的調(diào)節(jié)中起重要作用。

總之，本研究結(jié)果表明DHA 可以降低高脂食物誘導(dǎo)的體重增加，通過(guò)降低脂肪生成基因PPARγ，CEBPα 和SREBP1c 的表達(dá)，增加白色脂肪褐色化基因PGC1α 和UCP1 表達(dá)，增加靜止代謝率，從而增加能量支出，降低體重和體脂。