先天上頜尖牙缺失家系的致病基因的研究

楊 帆，姚思玥，于 鑫，范力文，潘永初，王 林

先天缺牙是人類(lèi)牙列中最常見(jiàn)的發(fā)育異常，在人群中的發(fā)病率為0.03%～10.10%[1]。根據(jù)其是否伴有其他系統(tǒng)或器官的異常，先天缺牙可分為綜合征型缺牙和非綜合征型缺牙兩大類(lèi)[2]。此外根據(jù)牙齒缺失數(shù)目的不同先天缺牙可以分為少數(shù)牙缺失(缺失恒牙數(shù)目少于6顆)，多數(shù)牙缺失(缺失恒牙數(shù)目大于等于6顆)以及全口牙齒缺失[3]。牙齒缺失位置和數(shù)目的不同會(huì)對(duì)患者造成不同程度的影響?；颊呔捉腊l(fā)音等功能甚至容貌、心理及社交都會(huì)受到影響[4]。

先天缺牙的致病機(jī)制比較復(fù)雜，基因和環(huán)境都在其發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。在大多數(shù)的缺牙病例中都呈現(xiàn)出一種遺傳傾向。其遺傳模式可能為常染色體顯性遺傳，常染色體隱性遺傳或伴X染色體遺傳[5]。近年來(lái)，隨著研究的逐步深入已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多基因與先天缺牙的致病相關(guān)，如MSX1(OMIM 142983),PAX9(OMIM 167416),EDA(OMIM 300451),AXIN2(OMIM 604025),WNT10A(OMIM 606268),LRP6(OMIM 603507)等。但先天缺牙的致病機(jī)制到目前為止尚不完全明確。

在人類(lèi)基因組中外顯子雖然只占1%～2%但卻包含了約85%的致病突變。因此全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為研究先天疾病在基因編碼區(qū)域變異特征的有效方法。本研究應(yīng)用全基因組外顯子測(cè)序的方法探究一個(gè)先天尖牙缺失家系可能的致病基因。

1 資料與方法

1.1 家系資料

本研究于2018年8月收集1個(gè)安徽省的先天上頜尖牙缺失的家系，該家系由3名成員組成，其中兩名為上頜尖牙缺失的患者(圖1a)。對(duì)該家系的所有成員進(jìn)行了詳細(xì)全身系統(tǒng)檢查以及口腔專(zhuān)科檢查并詳細(xì)地記錄病史及缺牙數(shù)目和位置。在患者和家屬簽署知情同意后，收集靜脈血樣本2 mL。本研究已通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PJ2004-030-001)。

A：缺牙家系遺傳系譜圖：Ⅰ1和Ⅱ1為先天缺牙患者；b～d：先證者(Ⅱ1)曲面斷層片及口內(nèi)照：53，63存， 13，23缺失；e～g：先證者父親(Ⅰ1)曲面斷層片及口內(nèi)照:53存，13缺失(24，36拔除)；h～j：先證者母親(Ⅰ2)曲面斷層片及口內(nèi)照：恒牙未發(fā)生缺失

圖1 遺傳系譜圖、曲面斷層X(jué)線(xiàn)片及口內(nèi)照

Fig.1 Pedigree structure, panoramic radiographic and intraoral photograph data of proband

1.2 方法

1.2.1 全基因組外顯子捕獲及測(cè)序 收集此家系的外周血2 mL并提取DNA。將DNA隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為180～280 bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后制備DNA文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)檢合格后即用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。樣本測(cè)序覆蓋度達(dá)到95%以上，測(cè)序深度為100X。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 ①測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估：Q20平均比例在90%以上，Q30平均比例在80%以上，平均錯(cuò)誤率在0.1%以下。②變異檢測(cè)：將高質(zhì)量序列對(duì)比到人參考基因組，并對(duì)檢出的變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和注釋。③變異篩選及疾病相關(guān)性預(yù)測(cè)：在1000Genomes Project、ESP6500siv2-all、gnomAD-EAS、gnomAD-ALL等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選突變頻率小于0.01的突變位點(diǎn)。并通過(guò)SIFT、CADD、PolyPhen-2、Mutation Taster工具預(yù)測(cè)突變的有害性，篩選至少上述3個(gè)工具預(yù)測(cè)為有害的位點(diǎn)。最終通過(guò)Phenolyzer進(jìn)行候選基因排名。選擇排名最靠前的基因作為候選基因。

1.2.3 候選基因驗(yàn)證 針對(duì)全基因組外顯子測(cè)序得到的相關(guān)突變位點(diǎn)，應(yīng)用Sanger測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。首先進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。正向引物序列為5′GGGGAAGGATTATGGAACAG3′，反向引物序列為5′AGTGTACTGCTTATGAACTAAACCA3′。根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增再進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.4 基因功能及突變氨基酸保守性分析 通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站TDD (http://bite-it.helsinki.fi/)查看該基因在小鼠牙胚中的表達(dá)情況。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取不同脊椎動(dòng)物物種的氨基酸序列，使用MEGA軟件(版本7.0.2)和MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)各物種間該氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表現(xiàn)

先證者為該家系的兒子(Ⅱ1)，經(jīng)口內(nèi)檢查及X線(xiàn)片證實(shí)：Ⅱ1 53，63存，13，23缺失(圖1b～d)。先證者父親(Ⅰ1)53存，缺失13(其中14，36因牙體疾病拔除)(圖1e～g)。先證者母親(Ⅱ1)未見(jiàn)牙齒缺失(圖1h～j)。該家系所有成員未見(jiàn)其他系統(tǒng)或器官異常。

2.2 突變檢測(cè)

全基因組外顯子測(cè)序后該家系共檢測(cè)出398 018個(gè)突變位點(diǎn)。數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)1000Genomes Project、ESP6500siv2-all、gnomAD-EAS、gnomAD-ALL數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)行篩選，去除頻率大于0.01的突變位點(diǎn)后剩余6 816個(gè)位點(diǎn)。進(jìn)一步去除非同義突變位點(diǎn)且僅保留有至少3個(gè)有害性預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)為有害的位點(diǎn)后僅剩余203個(gè)位點(diǎn)。其中有149個(gè)突變位點(diǎn)符合此家系的疾病共分離。再通過(guò)Phenolyzer (http://phenolyzer.wglab.org/)候選基因排序。最終在此家系中篩選出了候選致病基因ITGAV(c.C2831G:p.P794R)。

2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

對(duì)全基因組外顯子測(cè)序篩選出的致病突變進(jìn)行Sanger測(cè)序，證實(shí)該突變只在先證者和先證者的父親中存在，在其母親中并未發(fā)現(xiàn)此基因存在突變(圖2)。

先證者(Ⅱ1)和其父親(Ⅰ1)攜帶ITGAV突變：錯(cuò)義突變c.C2831G(p.P794R)。先證者的母親(Ⅰ2)未攜帶此ITGAV基因的突變

圖2 家系Sanger測(cè)序圖

Fig.2 Sanger sequencing chromatogram of the family

2.4 基因功能及氨基酸保守性預(yù)測(cè)

通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站TDD 發(fā)現(xiàn)ITGAV基因在小鼠磨牙牙胚的牙上皮、內(nèi)釉上皮、牙釉質(zhì)和牙乳頭中均有表達(dá)(圖3)。并通過(guò)MEGA(圖4a)和MEME(圖4b)發(fā)現(xiàn)該突變位置的脯氨酸在物種間具有高度保守性。

ITGAV在小鼠的磨牙牙胚的不同階段均有表達(dá)(彩色部分代表有表達(dá)的區(qū)域)：蕾狀期在牙上皮中有表達(dá)；帽狀期在內(nèi)釉上皮、牙釉質(zhì)和牙乳頭中有表達(dá)；鐘狀期在內(nèi)釉上皮中有表達(dá)

圖3ITGAV在小鼠磨牙牙胚中表達(dá)情況(http://bite-it.helsinki.fi/)

Fig.3 Expression ofITGAVin mouse molar germ(http://bite-it.helsinki.fi/)

(a)MEGA和 (b) MEME(http://meme-suite.org/tools/meme) 氨基酸保守性分析結(jié)果顯示ITGAV的p.P794位點(diǎn)(紅色箭頭所示位置)在不同物種間高度保守

圖4 保守性分析

Fig.4 Conservation analysis

3 討 論

先天缺牙是比較常見(jiàn)的發(fā)育異常，但先天缺牙的致病機(jī)制目前仍不完全明確。進(jìn)一步探究先天缺牙的致病基因并豐富其基因圖譜仍是我們目前的重要工作。本研究基于全基因組外顯子測(cè)序和生物信息學(xué)分析在一個(gè)上頜尖牙缺失的核心家系中發(fā)現(xiàn)ITGAV(c.C2831G:p.P794R)突變，該突變?yōu)殄e(cuò)義突變導(dǎo)致了氨基酸的改變。

ITGAV(Integrin Alpha-V)基因位于2q32.1，由30個(gè)外顯子構(gòu)成?？梢跃幋aITGAV蛋白。該蛋白由α亞基和β亞基構(gòu)成，其在細(xì)胞表面粘附和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，也參與細(xì)胞功能的調(diào)控。如胃癌細(xì)胞和人脂肪來(lái)源的干細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡都會(huì)受到ITGAV基因的調(diào)控[6]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)ITGAV與肝癌[7]、腸癌[8]等疾病相關(guān)。但目前為止并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此基因與先天缺牙相關(guān)。本研究首次在先天尖牙缺失的核心家系中發(fā)現(xiàn)其可能是尖牙缺失的致病基因。

ITGAV基因在眾多的組織和器官中均有表達(dá)如：口腔、甲狀腺、心臟、肝臟等(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)。除此之外該基因也參與牙齒的發(fā)育與形成(GSE48150，http://bite-it.helsinki.fi/)。如圖3所示，小鼠牙胚發(fā)育的早期階段(蕾狀期)檢測(cè)到該基因的表達(dá)。在小鼠牙胚的帽狀期和鐘狀期該基因在內(nèi)釉上皮、牙乳頭和釉結(jié)節(jié)中也有表達(dá)。在牙齒的發(fā)育過(guò)程中，內(nèi)釉上皮層由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成，可發(fā)育形成成釉細(xì)胞，參與牙釉質(zhì)的形成和礦化。而成釉細(xì)胞形成后可以對(duì)牙乳頭進(jìn)行誘導(dǎo)形成成牙本質(zhì)細(xì)胞，參與牙本質(zhì)的形成。牙乳頭是牙髓主要的組織來(lái)源也可以決定牙齒的形態(tài)。而釉結(jié)是調(diào)控牙齒早期形態(tài)的信號(hào)中心。ITGAV基因在牙齒發(fā)育的重要階段均有表達(dá)，可以說(shuō)明該基因?qū)ρ例X的發(fā)育發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)ITGAV可以與人骨橋蛋白結(jié)合[9]。眾所周知人骨橋蛋白在牙齒的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，其參與牙齒的礦化[10]。在牙齒的形成過(guò)程中牙齒礦化是必不可少的步驟。牙齒的形成和礦化由眾多的信號(hào)通路參與如：NF-κB信號(hào)通路[11]、Wnt信號(hào)通路、BMP信號(hào)通路[12]、MAPK/ERK信號(hào)通路等[13]。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ITGAV參與ERK信號(hào)通路的構(gòu)成(https://www.genecards.org/)。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵[14]。ERK信號(hào)通路與多種疾病相關(guān)如肺損傷[15]、腦缺血[16]、腸癌[17]等。除此之外ERK信號(hào)通路可以通過(guò)介導(dǎo)胞質(zhì)到胞核的信號(hào)傳導(dǎo)參與顱頜面部發(fā)育異常的形成[18]。近年來(lái)牙髓干細(xì)胞成為眾多學(xué)者研究牙齒發(fā)育的重要工具細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路參與牙髓干細(xì)胞的成牙過(guò)程：缺牙致病基因MSX1突變可以通過(guò)影響ERK的磷酸化進(jìn)一步影響牙髓干細(xì)胞的成牙及礦化[19]。因此我們推論ITGAV可能通過(guò)影響ERK信號(hào)通路的活性來(lái)調(diào)節(jié)牙齒的發(fā)育與形成。

綜上所述，本研究通過(guò)全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個(gè)先天上頜尖牙缺失家系存在ITGAV(c.C2831G:p.P794R)突變，該基因廣泛的參與牙齒的發(fā)育可能為該疾病的致病基因。