S100鈣結(jié)合蛋白A8在人慢性牙周炎牙齦組織巨噬細(xì)胞中表達(dá)的研究

劉利思,楊 婷，葉展鴻，孫 澎，王 剛，黃世光

S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8, S100A8)是S100蛋白家族的重要成員之一，主要由兩個(gè)不同螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)配基手型(EF-hand,EF手型)組成的低分子量(10.8 ku)鈣結(jié)合蛋白。S100A8通過(guò)對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用、激活炎性細(xì)胞和炎性因子的產(chǎn)生、介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1]。S100A8蛋白可特異性地表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞及髓系細(xì)胞，因此又稱為髓細(xì)胞相關(guān)蛋白-8(myeloid-related protein-8,MRP-8)，其功能取決于機(jī)體在特定炎癥環(huán)境中分泌的介質(zhì)及參與其識(shí)別的受體等[2]。S100A8在通常情況下可通過(guò)鈣離子依賴性方式與S100A9形成S100A8/S100A9異源性二聚體發(fā)揮其生物功能[3]。研究表明，在生理情況下S100A8/S100A9無(wú)炎癥活性，但在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等炎性因子的刺激下能誘導(dǎo)其炎癥活性[4]。雖然異源性二聚體形式是鈣衛(wèi)蛋白最常見(jiàn)存在的形式，但其單體S100A8或S100A9也可獨(dú)立存在并各自發(fā)揮其生物學(xué)功能[3]。在慢性牙周炎的發(fā)展過(guò)程中，細(xì)菌及其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物能夠刺激巨噬細(xì)胞(macrophages, m?)活化，導(dǎo)致活化的m?分泌大量的促炎因子，在宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。CD68是分布于細(xì)胞表面的分子量為110 ku的跨膜糖蛋白，在單核細(xì)胞表面較少，但向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化后表達(dá)CD68，因此CD68是最常用于標(biāo)記巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物[5-6]。以往研究主要聚集于鈣衛(wèi)蛋白二聚體的作用，而關(guān)于鈣衛(wèi)蛋白單體的研究報(bào)道較少。我們通過(guò)免疫熒光雙染色(double immunofluorescence，DIF)，觀察每組不同炎癥程度慢性牙周炎牙齦組織標(biāo)本中CD68-S100A8雙陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況，探討CD68-S100A8雙陽(yáng)性細(xì)胞在慢性牙周炎中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例選擇 2018年7月—2018年12月在中山市人民醫(yī)院牙周科和口腔頜面外科門診部就診的自愿接受本研究的60例受試者，年齡16～65歲,其中男26例，平均年齡(29.00±14.57)歲；女34例，平均年齡(33.00±13.02)歲，患有糖尿病及其他系統(tǒng)性疾病者需排除。臨床牙周炎患者選擇的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1999年美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)公布的牙周病新分類指南[7]。實(shí)驗(yàn)符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并獲得批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 分組及取材 ①正常對(duì)照組20例(16～45歲)：牙齦指數(shù)(gingival index，GI)=0，探診深度(probing depth，PD)≤3 mm， X線片顯示無(wú)牙槽骨吸收(圖1A)；②輕度牙周炎組20例(24～60歲)：取自因需要接受臨床牙冠延長(zhǎng)術(shù)者，GI=1，PD≤4 mm，臨床附著喪失(clinical attachment loss, CAL)為1～2 mm，X線片顯示牙槽骨吸收≤根長(zhǎng)1/3(圖1B)；③重度牙周炎組20例(31～65歲)：取自無(wú)法保留或預(yù)后差的需拔牙的重度牙周炎患者，GI=3，PD>6 mm，CAL≥5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收>根長(zhǎng)1/2，甚至達(dá)到根長(zhǎng)的2/3，牙齒松動(dòng)Ⅲ度(圖1C)。各組間受試者年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

A:正常對(duì)照組；B：輕度牙周炎組；C：重度牙周炎組

圖1 各組X線影像

Fig.1 X-ray images of each group

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織標(biāo)本的預(yù)備與處理 牙齦組織標(biāo)本于4%多聚甲醛溶液中固定時(shí)間48 h以上，隨后脫水、石蠟包埋，制成5 μm厚頰舌向牙齦組織連續(xù)切片用于后續(xù)染色。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE) 在光學(xué)顯微鏡下對(duì)牙齦組織進(jìn)行觀察。由2名病理醫(yī)師進(jìn)行盲法觀察，參照Huang等[8]的炎癥程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)牙齦組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行評(píng)分，取平均值。0分:無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);1分:輕度，牙齦組織中局部見(jiàn)炎癥細(xì)胞呈小灶狀浸潤(rùn);2分:中度，牙齦組織中見(jiàn)灶狀及片狀浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞;3分:重度，牙齦組織中可見(jiàn)彌漫性浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞。

1.2.3 S100A8-CD68雙陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光雙染色 Ⅰ抗：CD68抗體(Abcam),稀釋濃度為1∶100；S100A8抗體(北京博奧森)，稀釋濃度1∶200；Ⅱ抗：山羊抗小鼠鼠IgG(H+L)Alex Flour?555和山羊抗兔IgG(H+L) Alex Flour?488(cell signaling technology)，稀釋濃度1∶200。組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水，在修復(fù)盒經(jīng)微波爐加熱修復(fù)抗原；遮光條件下牛血清白蛋白(BSA)孵育、Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育行熒光染色，封片并立即在熒光顯微鏡下觀察拍照。紅色熒光為CD68陽(yáng)性表達(dá)，綠色熒光為S100A8陽(yáng)性表達(dá)，其定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，同一視野m?與S100A8重疊后為橘黃色熒光，藍(lán)色熒光信號(hào)表達(dá)為DAPI染出細(xì)胞核。染色切片置于熒光顯微鏡下，400倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0圖像處理軟件(美國(guó)Mdia Cybernetics)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用Spss 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)各組牙齦組織炎癥程度評(píng)分進(jìn)行比較；采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)3組標(biāo)本的CD68-S100A8雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行組間比較。設(shè)α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

正常對(duì)照組結(jié)締組織中罕見(jiàn)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)；輕度牙周炎組可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞呈散在分布(圖2B)；重度牙周炎組見(jiàn)上皮釘突增生，固有層中炎癥細(xì)胞大量聚集(圖2C)。慢性牙周炎組的炎癥程度評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

A:正常對(duì)照組；B：輕度牙周炎組；C：重度牙周炎組

圖2 各組牙齦組織的組織學(xué)觀察(HE染色 ×400)

Fig.2 Representative photomicrographs of human gingival tissues (HE staining ×400)

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05;#：與輕度牙周炎組比較，P<0.05

圖3 各組牙齦組織炎癥程度評(píng)分比較

Fig.3 Comparison of inflammatory scores of gingival tissues in each group

2.2 CD68和S100A8免疫熒光雙染色結(jié)果

m?為CD68+，在3組標(biāo)本中均可被檢出，各組牙齦組織CD68-S100A8雙陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光雙染色結(jié)果見(jiàn)圖4。紅色熒光信號(hào)表達(dá)是CD68(圖4A、E、I)，綠色熒光信號(hào)表達(dá)是S100A8(圖4B、F、J)，橘黃色熒光表達(dá)是在同一視野下紅色熒光與綠色熒光重疊(圖4D、H、L)，細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光(圖4C、G、K)。正常對(duì)照組：CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?在牙齦組織中少量散在分布(圖4A、B、C、D)；輕度牙周炎組：CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?數(shù)量在牙齦組織中明顯增加(圖4E、F、G、H)；重度牙周炎組：CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?在牙齦組織中可見(jiàn)大量聚集(圖4I、J、K、L)；各組牙齦組織標(biāo)本陰性對(duì)照未見(jiàn)熒光表達(dá)。

各組牙齦組織中，CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?密度(個(gè)/mm2)見(jiàn)圖5。3組標(biāo)本陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.074，P<0.05)；牙周炎組中CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?數(shù)量與正常對(duì)照組相比較明顯上升(P<0.05)；其中，重度牙周炎組CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?數(shù)量顯著多于輕度牙周炎組(P<0.05)。

3 討 論

慢性牙周炎是牙周致病菌引起的感染性疾病。在牙周炎的進(jìn)展中，牙周致病菌可直接損傷牙周組織，也可通過(guò)免疫炎癥反應(yīng)造成組織的損害。炎癥過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子和酶類如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)等可造成牙槽骨的吸收和有機(jī)基質(zhì)的降解[9]。研究發(fā)現(xiàn)在人慢性牙周炎牙齦組織中，有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及m?等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[10]。m?是一種具有吞噬殺傷功能的固有免疫細(xì)胞，也是存在于慢性牙周炎患者牙周組織中重要的炎癥細(xì)胞之一[11]。牙周組織中的m?來(lái)源于血液中的單核細(xì)胞，作為炎癥細(xì)胞在維持抗炎和促炎的免疫平衡中發(fā)揮重要作用，吞噬作用是防止細(xì)菌侵入牙周組織的一道防線，在防御的同時(shí)吞噬

A～D：正常對(duì)照組；E～H：輕度牙周炎組；I～L：重度牙周炎組。A、E、I為CD68+陽(yáng)性染色；B、F、J為S100A8陽(yáng)性染色；C、G、K為DAPI染色；D、H、L為CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?熒光染色

圖4 各組牙齦組織中CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?觀察(DIF染色 ×400)

Fig.4 Representative photomicrographs of CD68-S100A8 double positive m? in human gingival tissues (DIF staining ×400)

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05;#：與輕度牙周炎組比較，P<0.05

圖5 各組牙齦組織標(biāo)本中雙陽(yáng)性細(xì)胞密度的比較

Fig.5 Comparison of double positive cell density in gingival tissue of each group

細(xì)胞過(guò)度的免疫反應(yīng)可能會(huì)破壞牙周組織導(dǎo)致附著喪失和牙槽骨吸收[12]。m?可由于組織內(nèi)環(huán)境的改變和炎癥因子的誘導(dǎo)產(chǎn)生不同類型的m?，根據(jù)表型和功能特征主要分為兩種：經(jīng)典活化的m? (classically activated macrophage,caMphi)即M1型和替代性活化的m?(alternative activated macrophages，aaMphi)即M2型[13]。研究發(fā)現(xiàn)在慢性牙周炎進(jìn)程中，浸潤(rùn)在牙周組織中的m?主要為M1型，同時(shí)也觀察到少量M2型,并可釋放少量抗炎因子如白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，但其表達(dá)水平顯著低于促炎因子，故M1型m?可能在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起主要作用[14]。CD68是單核細(xì)胞譜系、循環(huán)巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞中高度特異性表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，可作為巨噬細(xì)胞的標(biāo)志。在炎癥環(huán)境中炎性因子的驅(qū)化作用下，外周血中單核細(xì)胞遷移到感染組織分化為巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部CD68+水平升高[5-6]。實(shí)驗(yàn)以CD68+作為m?的標(biāo)記，通過(guò)DIF發(fā)現(xiàn)CD68+的表達(dá)水平與牙周炎癥程度正相關(guān)，提示巨噬細(xì)胞參與牙周炎癥，其表達(dá)水平很大程度決定牙槽骨破壞的水平，結(jié)果與Radvar等[15]一致。

在炎癥環(huán)境中，特定的上皮細(xì)胞、活化的中性粒細(xì)胞及m?可釋放鈣衛(wèi)蛋白，鈣衛(wèi)蛋白被認(rèn)為是炎癥性疾病的標(biāo)志物[16]。研究發(fā)現(xiàn)與牙周健康者比較，慢性牙周炎患者的唾液、牙齦組織、齦溝液及血清中鈣衛(wèi)蛋白(S100A8/S100A9)的表達(dá)增高，且單體S100A8和S100A9在牙周炎進(jìn)展中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[17-18]。S100A8在調(diào)控炎癥發(fā)展過(guò)程中具有抗炎和促炎雙重調(diào)節(jié)作用，且被發(fā)現(xiàn)與侵襲性牙周炎個(gè)體易感性有關(guān)[19]。鄭云飛等[20]通過(guò)細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù)及劃痕法對(duì)牙周膜細(xì)胞遷移活性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在牙周炎活動(dòng)期高濃度的S100A8可以抑制牙周膜細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而參與組織破壞；在疾病后期或者經(jīng)過(guò)牙周治療后，較低濃度的S100A8卻可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞遷移，參與組織修復(fù)。在特定條件下如組織發(fā)生嚴(yán)重炎癥時(shí)，釋放到胞外的S100A8能刺激炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子如TNF-α、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等，直接參與炎癥疾病的過(guò)程并阻礙組織的恢復(fù)，加重炎癥程度，同時(shí)又可通過(guò)活化Toll樣受體4(Toll-like receptors, TLR4)以激活m?FcγRI和FcγRIV受體的表達(dá)[21]。TLR4是在Toll樣受體家族里最早被發(fā)現(xiàn)的成員之一，主要識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖結(jié)構(gòu)，因此在以革蘭陰性厭氧菌如牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)為主要致病菌的慢性牙周炎中發(fā)揮重要作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在人牙齦成纖維細(xì)胞中TLR4可能是鈣衛(wèi)蛋白的主要靶受體，鈣衛(wèi)蛋白介導(dǎo)的TLR4信號(hào)在轉(zhuǎn)錄因子核因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活中發(fā)揮重要作用[23]。查何[24]研究發(fā)現(xiàn)LPS和S100A8單獨(dú)或共同刺激m?后TLR4受體的表達(dá)水平較對(duì)照組升高，其中LPS和S100A8共同刺激效果最明顯，同時(shí)S100A8通過(guò)激活TLR4/ NF-κB信號(hào)通路，可促進(jìn)m?分泌炎性因子IL-1β及TNF-α從而造成組織損傷。然而，Thorey等[25]研究發(fā)現(xiàn)，S100A8能通過(guò)清除氧化物，防止過(guò)度氧化對(duì)機(jī)體造成損傷以促進(jìn)傷口愈合，發(fā)揮抗炎作用。Naruishi等[26]研究發(fā)現(xiàn)與S100A8相比，S100A9和鈣衛(wèi)蛋白二聚體可顯著增加牙齦成纖維細(xì)胞中IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和TNF-α的產(chǎn)生并參與牙周炎的炎癥反應(yīng)，提示S100A8的促炎作用可能相對(duì)較弱。但另有研究發(fā)現(xiàn)，在局部炎癥部位，聚集的高濃度S100A8可導(dǎo)致組織修復(fù)延遲，表明S100A8可能產(chǎn)生促炎作用參與組織破壞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)S100A9促炎作用并不明顯[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性牙周炎牙齦組織中CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?密度顯著高于正常組，活化或被招募的m?遷移到炎癥部位分泌S100A8，導(dǎo)致炎癥局部S100A8水平升高，提示m?(CD68+)參與S100A8的激活及釋放可直接造成牙周組織破壞并阻礙組織修復(fù)，從而促進(jìn)牙周炎癥進(jìn)展。迄今為止，S100A8在慢性牙周炎具體的作用機(jī)制不詳，仍有待進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)采用DIF，觀察人不同炎癥程度慢性牙周炎牙齦組織中S100A8在m?的表達(dá)情況，結(jié)果顯示S100A8和m?在同一細(xì)胞共定位，進(jìn)一步證實(shí)S100A8和m?關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，人慢性牙周炎牙齦組織的m?表達(dá)S100A8，重度牙周炎患者的牙齦組織中的 m?S100A8的表達(dá)顯著高于輕度牙周炎組，提示CD68-S100A8雙陽(yáng)性m?可能參與慢性牙周炎的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。我們的結(jié)果提示控制人慢性牙周炎組織中S100A8的合成或者調(diào)節(jié)m?的功能也許可成為阻止慢性牙周炎發(fā)展的一個(gè)新的途徑。