環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵染菌(Arthrobacter sp.AMP-5)的分離及16srDNA分析

段夢(mèng)露，李 皎，鄧 媛，毛 勇，楊國(guó)武

(陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)

0 前言

β-環(huán)糊精( β-cyclodextrin，β-CD) 是由 7 個(gè) D-吡喃葡萄糖基以 α-1，4 葡萄糖苷鍵連接成的環(huán)狀低聚糖。它具有中心疏水、外表面親水的圓臺(tái)形桶狀空間結(jié)構(gòu)，因此能夠包埋疏水性分子或者基團(tuán)從而形成包合物[1]。 經(jīng)過(guò)環(huán)糊精包埋以后的分子或基團(tuán)的理化性質(zhì)，比如水溶性、穩(wěn)定性、揮發(fā)性等都會(huì)發(fā)生改變，達(dá)到保護(hù)、穩(wěn)定、增溶客體分子的功能，所以β-CD廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、石油、化工、環(huán)保等諸多領(lǐng)域[2～4]。

β-CD由β-CGTase作用于淀粉后使葡萄糖基發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)而獲得[5]，是具有高附加值的淀粉深加工產(chǎn)物，目前國(guó)內(nèi)主要以玉米淀粉為生產(chǎn)原料。β-CGTase的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)大部分采用嗜堿性芽孢桿菌純培養(yǎng)完成[6～8]。在生產(chǎn)初期，由于培養(yǎng)條件的強(qiáng)堿性(pH>9)，發(fā)酵染菌的幾率極低。但是長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)生產(chǎn)導(dǎo)致環(huán)境中的嗜堿性菌群增加，生產(chǎn)廠家發(fā)酵染菌的現(xiàn)象越來(lái)越多，雜菌污染可能導(dǎo)致產(chǎn)品酶活降低，產(chǎn)量下降，從而直接影響生產(chǎn)效益，嚴(yán)重的已經(jīng)發(fā)生連續(xù)倒罐，生產(chǎn)停滯，嚴(yán)重增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本和負(fù)擔(dān)[9,10]。

我們團(tuán)隊(duì)多年來(lái)致力于研究環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，研究水平已處于國(guó)際領(lǐng)先水平。我們?cè)趯?duì)生產(chǎn)廠家進(jìn)行技術(shù)服務(wù)過(guò)程中，在發(fā)酵異常的發(fā)酵液中分離到了一株在堿性條件下可以和正常生產(chǎn)菌共生的節(jié)桿菌，通過(guò)16sDNA分析發(fā)現(xiàn)該雜菌為節(jié)桿菌Arthrobacter sp.AMP-5。對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌優(yōu)先于生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵，形成優(yōu)勢(shì)菌群并降低發(fā)酵液pH值，進(jìn)而抑制生產(chǎn)菌的增殖。由于β-CGTase生產(chǎn)屬于正壓發(fā)酵，發(fā)酵污染的來(lái)源可能是空氣過(guò)濾系統(tǒng)或菌種污染，因此通過(guò)預(yù)先鑒定生產(chǎn)菌種以及凈化空氣過(guò)濾系統(tǒng)，可以防止發(fā)酵染菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌株H02S：從生產(chǎn)廠家發(fā)酵異常的發(fā)酵液中分離得到嗜堿性蠟狀芽孢桿菌：陜西省微生物研究所保藏β-CGTase生產(chǎn)菌種其他試劑購(gòu)自市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽消毒器(YX-400ZN，上海三申醫(yī)療器械有限公司)；生物發(fā)酵智能控制系統(tǒng)及GUJS-10發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(GH-600ASB，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-2012，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(S1000，美國(guó)bio-rad公司)；水平式核酸電泳槽；紫外儀(WD-9430F，北京六一儀器制造廠)；小型震蕩儀(QL-901Vortox, 海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；精密臺(tái)式數(shù)顯pH計(jì)(PB-10，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；722N型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液酶活測(cè)定方法 采用碘液法測(cè)定β-CGTase 水解活性[11]。取 10 μL發(fā)酵液與0.2 mL Tris-HCl緩沖液(pH8.0)混合，再加入0.25%馬鈴薯淀粉溶液0.2 mL，振蕩，于40℃水浴中反應(yīng)10 min 后，立即置于冰水浴中并加入0.5 molc 醋酸溶液 0.5 mL 終止反應(yīng)，再加入 3 mL 0. 05 g ·L-1碘液顯色，同時(shí)以蒸餾水為空白，不加酶液為對(duì)照，在700 nm波長(zhǎng)下比色。一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘減低 10% 吸光度所需酶量。

一個(gè)酶活單位(U)=(a-b)/a×1000×酶液稀釋倍數(shù)

式中：a 為對(duì)照組的吸光度；b為樣品的吸光度。

1.2.2 發(fā)酵液光密度測(cè)定方法 吸取發(fā)酵液2 mL，以蒸餾水定容到50 mL，在單色波長(zhǎng)600 nm處測(cè)得光密度值。

1.2.3 雜菌的篩選和分離 分離培養(yǎng)基：玉米漿(6%)，七水硫酸鎂(0.02%)，磷酸氫二鉀(0.1%)，馬鈴薯淀粉(1.5%)，瓊脂(2%)，溶解后調(diào)pH到7.0，加入無(wú)水碳酸鈉1%。

篩選培養(yǎng)基：以分離培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0.03%酚酞。

取發(fā)酵液按10的倍數(shù)逐級(jí)梯度稀釋?zhuān)謩e在分離培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 采用16srDNA技術(shù)進(jìn)行菌種分析、鑒定 提取菌種的基因組DNA。根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA的保守性，設(shè)計(jì)通用引物序列為，F(xiàn)：5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3；R：5- TAC GGC TACCTTGTTACG ACTT-3，以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃熱變性5 min；94 ℃/40 s，55℃/40 s，72℃/2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。目的片段經(jīng)膠回收和純化后，連接于 pGM-T 載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E．coli DH5α中， 37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落培養(yǎng)并使T7和SP6測(cè)序引物進(jìn)行菌落 PCR驗(yàn)證 。PCR條件：95℃熱變性10 min；94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，共 30個(gè)循環(huán) ；72℃延伸 10 min。將驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆子菌液送至楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司測(cè)序。使用BLAST搜索軟件在NCBI的GeneBank基因庫(kù)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析和檢索，篩選出與目的菌種相似度匹配最高的種屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 H02S菌種的分離篩選

對(duì)環(huán)糊精生產(chǎn)車(chē)間中發(fā)酵異常的發(fā)酵液進(jìn)行分離篩選， 獲得一株可在強(qiáng)堿性(pH>9)的篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的菌種H02S。如圖1所示，1為將一片蓋玻片置于培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基和pH試紙分離，試紙不變色，進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)試紙的顯色是由堿性培養(yǎng)基引起的，與環(huán)境因素?zé)o關(guān)。菌落2為產(chǎn)β-CGTase的正常菌菌落，該菌落可在堿性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)(pH試紙顯色為堿性)，且菌落周?chē)a(chǎn)生褪色圈，這是由于正常菌產(chǎn)生的β-CGTase將培養(yǎng)基中的淀粉轉(zhuǎn)化為β-CD，β-CD包埋培養(yǎng)基中的酚酞從而在菌落周?chē)a(chǎn)生了褪色圈。菌落3為分離雜菌H02S，該雜菌雖然可在強(qiáng)堿性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(pH試紙顯色為堿性)，但不能生產(chǎn)分泌β-CGTase，所以菌落周?chē)鸁o(wú)褪色圈。

2.2 H02S菌種的16SrDNA分析

對(duì)H02S進(jìn)行16SrDNA克隆和測(cè)序，使用BLAST在GeneBank基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索和多序列比對(duì)，如圖2所示，經(jīng)比對(duì)H02S應(yīng)歸屬于Arthrobacter sp.AMP-5，與正常生產(chǎn)菌種屬不同。

2.3 H02S菌種發(fā)酵生長(zhǎng)曲線

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，以相同培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，并記錄兩種菌的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線。如圖3所示，在0～8 h之間，兩種菌的生長(zhǎng)速度幾乎相同，隨后8～16 h之間雜菌H02S的生長(zhǎng)速度高于正常菌，且雜菌在16 h菌體密度達(dá)到峰值，而生長(zhǎng)至16 h之后，正常菌的菌體密度超過(guò)雜菌H02S。由此分析，在工業(yè)生產(chǎn)中，如果發(fā)酵罐染菌，雜菌會(huì)優(yōu)先于生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵，形成優(yōu)勢(shì)菌群從而抑制正常生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵失敗。

2.4 H02S菌種發(fā)酵pH值變化曲線

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，以相同培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，并記錄兩種菌發(fā)酵過(guò)程中的pH值變化。如圖4所示，兩種菌的發(fā)酵過(guò)程中pH值均呈現(xiàn)先下降后略有上升的趨勢(shì)。由此分析，在工業(yè)生產(chǎn)中可能H02S優(yōu)先于生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵，使發(fā)酵液pH值降低，不利于正常生產(chǎn)菌的增殖，并且增加了污染環(huán)境中其他雜菌的可能性。

2.5 H02S菌種發(fā)酵過(guò)程中的酶活變化

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，以相同培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，并記錄兩種菌發(fā)酵過(guò)程中的酶活的變化。如圖5所示，正常生產(chǎn)菌的酶活在28 h達(dá)到峰值4 257.41 U·mL-1，而H02S則不產(chǎn)酶。

3 結(jié)論

本團(tuán)隊(duì)在對(duì)β-CGTase生產(chǎn)廠家進(jìn)行技術(shù)服務(wù)過(guò)程中，在發(fā)酵異常的發(fā)酵液中分離到了一株在堿性條件下可以和正常生產(chǎn)菌共生的雜菌H02S；對(duì)該雜菌進(jìn)行16srDNA基因分析鑒定，發(fā)現(xiàn)該雜菌為節(jié)桿菌Arthrobacter sp.AMP-5；將該雜菌與正常生產(chǎn)菌分別進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵初期雜菌H02S的生長(zhǎng)速度明顯高于正常菌，同時(shí)pH值快速下降，且發(fā)酵全程H02S不產(chǎn)酶。根據(jù)多年生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，由于β-CGTase生產(chǎn)屬于正壓發(fā)酵，發(fā)酵污染的來(lái)源可能是空氣過(guò)濾系統(tǒng)或菌種污染，導(dǎo)致了節(jié)桿菌優(yōu)先于正常菌生長(zhǎng)，迅速形成優(yōu)勢(shì)菌群，消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)降低了發(fā)酵液pH值，抑制正常菌的生長(zhǎng)導(dǎo)致發(fā)酵失敗。因此，在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)β-CGTase時(shí)，應(yīng)預(yù)先采用16srDNA基因序列分析鑒定生產(chǎn)菌種，排除染雜菌的菌種；發(fā)酵崗位操作員也應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行空消和實(shí)消操作，定期排空空氣壓縮機(jī)儲(chǔ)罐內(nèi)積水，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的酶活和pH值進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以期及早發(fā)現(xiàn)發(fā)酵污染，并從源頭上消除發(fā)酵染菌的可能性。