薄層色譜法的操作要點(diǎn)及影響因素

李 楊 姜慧瑩 陳嘉興 楊 爽 黃 帥（吉林職業(yè)技術(shù)學(xué)院延邊133400）

薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi)，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖對(duì)比[1，2]。薄層色譜法的操作分別是供試品溶液的制備、對(duì)照品或?qū)φ账幉娜芤旱闹苽洹⑦x擇吸附劑、點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色與檢視。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 供試品溶液的制備：根據(jù)選取的目標(biāo)成分選用適宜的提取方法和提取溶劑，常用的提取方法包括浸泡、振搖、超聲等法、加熱回流等。提取的目標(biāo)成分沸點(diǎn)較低，在提取時(shí)應(yīng)注意不可加熱提取，應(yīng)超聲或振搖浸泡提取，制備時(shí)不應(yīng)受熱，在鑒別牡丹皮時(shí)，由于丹皮酚沸點(diǎn)為31℃，高溫蒸干后，丹皮酚易揮發(fā)，高溫?fù)]干和室溫?fù)]干的薄層色譜圖。如圖1所示。

1.2 選擇吸附劑：預(yù)制薄層板按固定相種類(lèi)分為硅膠薄層板、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常用的有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H 、硅膠HF254、G、H 表示含或不含石膏黏合劑。F254為在紫外光254 nm波長(zhǎng)下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10～4 μm）和髙效薄層板（5～10 μm）。自制的薄層板。固定相顆粒大小一般要求粒徑為10～40 pm。玻板應(yīng)光滑、平整，洗凈后不附水珠。黏合劑通常為羧甲基纖維素鈉，配制時(shí)應(yīng)均勻散落在水的表面，自然沉降，固定相與黏合劑通常為1∶3，混合后，沿一個(gè)方向研磨排除氣泡。稠度以用研棒黏取呈連珠狀而不呈線狀下滴為好[2]。薄層板鋪制完成后，置110℃下干燥30 min[3，4]。

在黏合劑加入適量的氫氧化鈉，鋪制的薄層板，在分離一些酸性成分時(shí)要優(yōu)于硅膠G薄層板的分離效果，例如丹參的薄層色譜鑒別，分別選用硅膠G薄層板和堿板，同一條件下，堿板的分離效果較好，如圖2所示。

1.3 點(diǎn)樣：一般采用微升毛細(xì)管點(diǎn)樣，也可用自動(dòng)點(diǎn)樣器。在薄層板點(diǎn)樣的斑點(diǎn)一般呈圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀，根據(jù)特征斑點(diǎn)在薄層色譜顯現(xiàn)的效果，選擇點(diǎn)樣方式。例如，黃芪的薄層色譜，在點(diǎn)樣的斑點(diǎn)呈圓點(diǎn)狀時(shí)，薄層色譜背景較深，可以選擇條帶狀點(diǎn)樣，使薄層色譜的背景拉伸變淺，特征斑點(diǎn)清晰，薄層色譜如圖3。

1.4 展開(kāi)：展開(kāi)前如需要溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開(kāi)缸中加入適量的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15～30 min。溶劑蒸氣預(yù)平衡后，應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開(kāi)。如需使展開(kāi)缸達(dá)到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則須在展開(kāi)缸的內(nèi)壁貼與展開(kāi)缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開(kāi)劑，密閉一定時(shí)間，使溶劑蒸氣達(dá)到飽和再如法展開(kāi)。如薄層色譜在分離生物堿時(shí)，需要在置氨蒸氣飽和的展開(kāi)環(huán)境中展開(kāi)，例如黃連的薄層色譜鑒別，未用濃氨溶液飽和的展開(kāi)環(huán)境或氨蒸汽的濃度低都會(huì)導(dǎo)致薄層色譜的Rf值降低或主斑點(diǎn)不清晰，見(jiàn)圖4。

1.5 顯色與檢視：有顏色的物質(zhì)可在可見(jiàn)光下直接檢視，無(wú)色物質(zhì)可用噴霧法或浸潰法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在可見(jiàn)光下檢視。有熒光的物質(zhì)或顯色后可激發(fā)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可在紫外光燈（365 nm或254 nm）下觀察熒光斑點(diǎn)。對(duì)于在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠GF254板），在紫外光燈（254 nm）下觀察熒光板面上的熒光物質(zhì)淬滅形成的斑點(diǎn)。厚樸的薄層色譜鑒別，薄層色譜在經(jīng)過(guò)碘蒸氣氧化后，在紫外254 nm下檢視，其特征斑點(diǎn)相比于未經(jīng)碘蒸氣氧化更加清晰，如圖5。

2 結(jié)果與討論

薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層上，在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi)，供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖對(duì)比[1]，廣泛用于鑒別、檢査。其操作步驟中，影響因素較多，本研究于各操作步驟中選取實(shí)際應(yīng)用的影響因素，討論薄層色譜在應(yīng)用時(shí)的技術(shù)難點(diǎn)[5]。供試品溶液制備時(shí)需注意目標(biāo)成分的熔沸點(diǎn)，以此作為依據(jù)進(jìn)行供試品的制備。吸附劑的選擇要根據(jù)所分離的某一類(lèi)目標(biāo)成分來(lái)選擇，中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，為薄層色譜檢測(cè)帶來(lái)許多困難，依據(jù)目標(biāo)成分性質(zhì)選擇適宜的吸附劑對(duì)于薄層色譜的分離存在較大影響。薄層色譜多用圓點(diǎn)點(diǎn)樣，條形點(diǎn)樣應(yīng)用較少，對(duì)于皂苷分離效果不好的成分可以采用條形點(diǎn)樣的方式，使目標(biāo)成分的特征斑點(diǎn)在分離條帶中剝離得更加清晰。薄層色譜展開(kāi)操作中，氨水預(yù)飽和可以用于皂苷、生物堿的分離，根據(jù)成分間的相似相溶原理，薄層色譜目標(biāo)成分斑點(diǎn)更加清晰，分離度較高。薄層色譜法檢視主要分為三種方式，日光檢視、紫外365 nm檢視、紫外254 nm檢視，可以根據(jù)特征成分的特性選擇適宜的氧化還原顯色劑，使檢視斑點(diǎn)更加清晰。