生長(zhǎng)分化因子9對(duì)牛顆粒細(xì)胞孕酮合成影響的研究

李長(zhǎng)志，李 偉，宋偉紅，張洪濤，張金友

（黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱150038）

卵巢內(nèi)來源于卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的很多因子，對(duì)于調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生發(fā)育、刺激或抑制卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞功能等方面發(fā)揮著重要作用。這些因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）超家族中的成員之一GDF9［1-3］。很多研究已經(jīng)證實(shí)，在奶牛［4-5］、綿羊［6］和嚙齒動(dòng)物［7］中GDF9主要表達(dá)在初級(jí)卵泡到大卵泡時(shí)期的卵母細(xì)胞中。也有研究顯示，GDF9在排卵后的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中也有表達(dá)［8-9］。因此GDF9可能對(duì)卵泡的發(fā)生和維持卵泡的功能及在卵泡排卵后都具有重要作用。

已有研究證實(shí)，在有無FSH存在條件下GDF9都可以誘導(dǎo)、提高小鼠壁層顆粒細(xì)胞StAR基因表達(dá)［10］和孕酮的合成［10-11］。而在人的研究中發(fā)現(xiàn)，GDF9抑制了人顆粒細(xì)胞基礎(chǔ)和cAMP刺激的StAR和P450scc基因表達(dá)［12］以及孕酮的合成。GDF9可以通過逆轉(zhuǎn)激活素A（Activin A）抑制人黃體性顆粒細(xì)胞StAR表達(dá)和孕酮生成［13］。然而，鼠源GDF9可以刺激綿羊顆粒細(xì)胞的孕酮合成［14］。另有研究顯示，孕酮可以反過來促進(jìn)卵泡細(xì)胞中GDF9的表達(dá)［15］。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間具有可以互相協(xié)調(diào)發(fā)育的信息通路［16-17］。因此，綜合現(xiàn)有的諸多研究結(jié)果可以看出，GDF9在反芻動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和人上的作用有著很大的差異。

目前已知GDF9在牛的顆粒細(xì)胞中可以表達(dá)［18］。并且有研究顯示GDF-9可以抑制FSH誘導(dǎo)的牛顆粒細(xì)胞孕酮合成［19］；但是學(xué)者們對(duì)于GDF9在牛顆粒細(xì)胞中的作用顯然知之甚少。當(dāng)卵泡排卵之后，殘留的壁層顆粒細(xì)胞脫離了含有卵母細(xì)胞的封閉卵泡微環(huán)境，開始了特殊的分化過程。然而目前還無法清楚地知道GDF9對(duì)其自身的分化和類固醇合成能力具有哪些影響。對(duì)于這個(gè)問題的探索將有助于更清楚地了解壁層顆粒細(xì)胞是如何分化為黃體細(xì)胞的。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM/F12［Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing Ham’s F12 medium，1∶1（v/v）］、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和Phosphate buffer saline（PBS），購(gòu)自Gibco Life Technologies公司；重組小鼠GDF9，購(gòu)自R&D生物制品公司；其他未特殊說明的試劑均購(gòu)自Sigma- Aldrich Chemical Co.；孕酮放射性免疫檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；35 mm塑料培養(yǎng)皿，購(gòu)自Nalge Nunc International。

1.2 試驗(yàn)步驟及方法

1.2.1 牛顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng) 在本地屠宰場(chǎng)選擇未妊娠奶牛，根據(jù)J.A.Arosh等［20］的描述，選擇發(fā)情周期16～21 d卵巢，屠宰后20 min內(nèi)放入盛有生理鹽水溶液的無菌燒杯中，37℃條件下2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，立即用于試驗(yàn)。選擇2～8 mm大小的卵泡，用裝有20號(hào)針頭的一次性無菌注射器抽取其中的卵泡液和顆粒細(xì)胞。將收集到的顆粒細(xì)胞和卵泡液混合液放入15 mL離心管中，靜止至少5 min，等待卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體下沉。吸取懸浮液放入離心管中200×g離心5 min，棄去上清液。向沉淀中加入DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕吹散沉淀，重復(fù)上述離心過程3次，清洗顆粒細(xì)胞。最后一次離心后棄去上清液，向沉淀中加入少量DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕吹打，混合均勻。

在37℃培養(yǎng)箱中取出已經(jīng)放入FBS包被24 h的35 mm塑料培養(yǎng)皿，用PBS沖洗3次。吸取適量顆粒細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色，并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)算活細(xì)胞濃度。用DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，使放入每個(gè)培養(yǎng)皿中的活細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)。向培養(yǎng)皿中補(bǔ)足DMEM/F12培養(yǎng)液至1 mL，將培養(yǎng)皿放入含有5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 GDF9處理顆粒細(xì)胞 待培養(yǎng)24 h顆粒細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)之后，取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，用37℃的PBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿3次，向4個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入1 mL如下4種培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h：1）DMEM/F12；2）DMEM/F12+GDF9（600 ng/mL）；3）DMEM/F12+10% FBS；4）DMEM/F12+10% FBS+GDF9（600 ng/mL）。

1.2.3 孕酮含量的測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液放入冰箱中冷凍保存，待測(cè)孕酮含量。吸出培養(yǎng)液后用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化3 min，用等體積的含血清培養(yǎng)液終止消化，吹勻。收集所有細(xì)胞放入離心管中，300×g離心5 min，小心吸除上清液，加入500μL PBS混勻。取適量細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度，重復(fù)3次，取平均值。然后計(jì)算每份樣品中的細(xì)胞總數(shù)，將細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為n×105個(gè)。根據(jù)孕酮放射性免疫檢測(cè)試劑盒操作說明書，對(duì)樣品中孕酮濃度進(jìn)行測(cè)定，每份樣品做3個(gè)平行檢測(cè)。試劑盒的檢測(cè)靈敏度為0.2 ng/mL，組間和組內(nèi)變異系數(shù)分別為10%和6%。測(cè)得的孕酮濃度為每毫升培養(yǎng)液中的孕酮量，單位為ng/mL。

1.2.4 油紅染色 將500 mg油紅粉末溶于100 mL異丙醇中作為濃貯液。取適量濃貯液用濾紙過濾，按照濾液6 mL+超純水4 mL的比例混合，配制工作液。取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸除培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定20 min。倒掉甲醛溶液，用PBS小心沖洗細(xì)胞后加入油紅工作液，避光染色10 min。然后棄掉油紅，加入蘇木精染色液染色1 min。再用PBS沖洗培養(yǎng)皿2遍，加入適量PBS蓋住皿底，在顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)與染色結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出：牛顆粒細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，逐漸趨于扁平狀，細(xì)胞核清晰可見。在顆粒細(xì)胞間開始相互接觸之后細(xì)胞間界限不明顯，大部分細(xì)胞失去梭形狀態(tài)，變?yōu)殇伮肥螒B(tài)（見圖1A）。牛顆粒細(xì)胞具有合成孕酮的能力，正如其他類固醇合成細(xì)胞一樣，圍繞細(xì)胞核區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)中分布著明顯的顆粒樣脂滴（見圖1B）。

2.2 GDF9對(duì)顆粒細(xì)胞孕酮含量的影響

GDF9對(duì)顆粒細(xì)胞孕酮合成的影響見圖2。

在無血清培養(yǎng)條件下，顆粒細(xì)胞的基礎(chǔ)孕酮含量為（39.45±4.57）ng/mL；在600 ng/mL重組小鼠GDF9的刺激下，顆粒細(xì)胞的孕酮含量顯著提高（P＜0.05），達(dá)（257.68±10.38）ng/mL；而在添加10%FBS的培養(yǎng)體系中，顆粒細(xì)胞的孕酮含量比無血清組顯著增加（P ＜0.05），達(dá)（126.45±7.59）ng/mL，但卻顯著低于僅添加的GDF9組（P＜0.05）；在有FBS存在的情況下同樣添加600 ng/mL重組小鼠GDF9后，顆粒細(xì)胞的孕酮含量顯著增加，達(dá)（798.78±273.98）ng/mL，顯著高于其他各組（P＜0.05）。

3 討論

隨著排卵前黃體生成素（LH）峰的出現(xiàn)，一些復(fù)雜的因素誘發(fā)了卵泡破裂并排出卵子。卵泡壁塌陷之后，卵泡的殘留組織經(jīng)過分化和發(fā)育最終形成黃體組織。這個(gè)黃體化過程使得卵巢合成的主要激素由原來的雌激素變?yōu)樵型?。在黃體中含有兩種類固醇生成細(xì)胞，即大黃體細(xì)胞和小黃體細(xì)胞，前者由卵泡壁殘留的顆粒細(xì)胞分化形成，后者由殘留的膜細(xì)胞分化形成。這兩種黃體細(xì)胞合成孕酮的能力存在很大區(qū)別。大黃體細(xì)胞合成了中期黃體分泌的80%以上孕酮，而小黃體細(xì)胞僅合成了一小部分孕酮［21-22］。大黃體細(xì)胞的這種高水孕酮合成能力并不會(huì)受到生理濃度LH的影響，小黃體細(xì)胞的孕酮合成水平卻受到LH或dbcAMP的強(qiáng)烈刺激［23-24］。因此，以顆粒細(xì)胞為模型研究調(diào)控孕酮合成的影響因素和機(jī)制將有助于理解大黃體細(xì)胞如何維持其高水平的孕酮合成能力。

顆粒細(xì)胞合成孕酮的底物膽固醇來自于通過其細(xì)胞表面受體攝入的低密度脂蛋白。當(dāng)?shù)兔芏戎鞍姿?，放出更多的膽固醇到?xì)胞質(zhì)中后，這些游離的膽固醇一部分被用于合成類固醇激素和參與形成細(xì)胞膜，另一部分經(jīng)膽固醇酯合成酶的酯化作用與脂肪酸結(jié)合，形成膽固醇酯并儲(chǔ)存于細(xì)胞質(zhì)的脂滴中。而當(dāng)細(xì)胞需要?jiǎng)佑酶嗟哪懝檀紩r(shí)，脂滴中的膽固醇酯會(huì)在膽固醇酯酶的水解作用下釋放出游離膽固醇供細(xì)胞使用。細(xì)胞質(zhì)中這些含有膽固醇酯的脂滴一直被認(rèn)為是類固醇生成細(xì)胞的重要形態(tài)學(xué)特征。在本試驗(yàn)中分離的牛顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有大量的顆粒性脂滴。經(jīng)過油紅染色后脂滴被染成紅色。因此，即使是小卵泡中的顆粒細(xì)胞也具有類固醇生成細(xì)胞的典型特征，而這一特征為其持續(xù)的類固醇合成和將來的黃體化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

在排卵前的卵泡中，卵母細(xì)胞來源的GDF9通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和抑制孕酮合成，促進(jìn)卵泡正常發(fā)育和阻止顆粒細(xì)胞過早的黃體化［12，19，25］。GDF9雖然被證實(shí)主要在卵母細(xì)胞中表達(dá)，但是也有研究發(fā)現(xiàn)牛顆粒細(xì)胞中也有GDF9表達(dá)［20］。當(dāng)卵泡排卵后，殘留的顆粒細(xì)胞失去了卵母細(xì)胞旁分泌的影響，立即進(jìn)入了黃體化過程，其合成的激素將轉(zhuǎn)變成以孕酮為主。一些體外研究已經(jīng)證實(shí)，GDF9具有促進(jìn)孕酮合成的作用［10-11，14］。同樣，本試驗(yàn)結(jié)果表明，體外添加GDF9之后無血清培養(yǎng)組和血清培養(yǎng)組顆粒細(xì)胞孕酮的合成水平明顯提高。

綜上所述，體外培養(yǎng)的牛顆粒細(xì)胞保持著類固醇合成細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征，具備合成孕酮的基本條件；排卵后顆粒細(xì)胞內(nèi)的GDF9可能參與了促進(jìn)顆粒細(xì)胞向黃體細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程，但是介導(dǎo)這一過程的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究和探討。