土壤酸脅迫對黑麥草生長生理及鎘富集特征的影響

戴學斌,許瑜興,鄧 義,馬佳珠,陳莉莉,穆興民

(1.玉溪師范學院 地理與國土工程學院,云南 玉溪 653100;2.中國科學院 水利部 水土保持研究所,陜西 楊凌 712100)

土壤重金屬鎘(Cd)污染問題已經(jīng)引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。Cd是毒性非常強的一種重金屬，易被作物吸收后通過食物鏈危害到人類健康。我國南方地區(qū)Cd污染程度比北方地區(qū)高[1]，加之南方地區(qū)土壤酸化尤為嚴重[2]，更加劇了土壤Cd污染[3]。因此，解決我國南方土壤酸化條件下Cd污染問題尤為迫切。植物修復技術(shù)是利用修復植物對土壤中的重金屬進行固定，通過收獲植物降低土壤中的重金屬含量，從而達到修復目的[4]。與傳統(tǒng)的物理修復和化學修復方法相比，植物修復以其環(huán)境友好及成本低等優(yōu)勢成為重金屬污染治理研究領(lǐng)域的熱點，其中修復植物的選擇是植物修復最關(guān)注的內(nèi)容[5-6]。目前，已有文獻報道的Cd富集植物有寶山堇菜(Violabaoshanensis)[7]、商陸(Phytolaccaamericana)[8]、龍葵(Solanumnigrum)[9]、三葉鬼針草(Bidenspilosa)[10]、滇苦菜(Picrisdivaricata)[11]、東南景天(Sedumalfredii)[12]和忍冬(Lonicerajaponica)等[13]，但這些植物因其生物量較小，或因環(huán)境適應性較差等因素，未被大面積地推廣及應用，不能滿足對土壤Cd污染治理的需求。且目前用于Cd污染修復的植物多是一年生植物，其地上部分在生長季結(jié)束后發(fā)生脫落，不能連年覆蓋于地表，因此起不到很好的植物修復效果[14]。當前有關(guān)Cd富集植物的研究多集中在雜草[10]、蔬菜[15]和農(nóng)作物[16]，通過草本花卉進行土壤修復的研究剛剛興起。草本花卉作為修復植物，在進行Cd污染土壤修復的同時，還可以增加綠化量以及美化環(huán)境。

多年生黑麥草(Loliumperenne)為禾本科黑麥草屬多年生草本花卉植物，對Cd有很強的耐性和富集能力，其分布廣、易栽培、生長速度快、根系發(fā)達、耐性強、可多次刈割并再生，因此在土壤Cd污染植物修復方面具有重要的研究及應用價值[17]。關(guān)于Cd對黑麥草的脅迫已有許多的文獻報道[14,17-18]，但目前對黑麥草在酸性土壤中的種植研究還相對較少，對黑麥草在酸脅迫下的適應策略尚不太清楚。因此，本研究是以Cd富集植物黑麥草為研究對象，通過盆栽試驗研究不同強度酸脅迫對黑麥草種子萌發(fā)、植物生長生理及Cd富集特征的影響，旨在探討黑麥草對土壤酸脅迫的耐性和對Cd污染土壤修復的可行性。為我國南方土壤酸化條件下Cd污染土壤的植物修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為在南方酸性紅壤地區(qū)分布廣泛且生長良好的Cd富集植物多年生黑麥草，黑麥草種子購于玉溪花鳥市場。供試土壤采自玉溪地區(qū)未受Cd污染的0—20 cm表層混合土壤，除去石塊樹枝等雜質(zhì)，將土樣自然風干、磨細和過篩(5 mm)，供盆栽試驗使用(土壤pH值4.5，有機質(zhì)9.55 g/kg，全氮1.09 g/kg，全磷0.40 g/kg，Cd背景值0.14 mg/kg)。試驗過程中所用的試劑硫酸、氫氧化鈉、氯化鎘等均為分析純。

1.2 試驗設計

將制備好的土壤裝入到塑料花盆(盆口直徑32 cm×底徑20 cm×高22 cm)，每盆裝土4 kg。設置4種酸脅迫水平：以溶液形式往供試土壤中添加硫酸和氫氧化鈉，使土壤pH值為4.0，4.5，5.0，6.0，混勻后，靜置10 d。Cd濃度設置100，0 mg/kg兩個處理，方法是將一定量CdCl2溶液加入土壤中，混勻，在室內(nèi)靜置30 d后進行盆栽試驗，期間添加純凈水4次，使土壤能夠保持濕潤。試驗一共8個處理，每個處理3個重復。試驗土壤基本理化性質(zhì)見表1，Cd0和Cd100土壤中的有機質(zhì)、全氮和全磷含量在土壤pH值為4.0時均較低；隨著土壤pH值升高，土壤有機質(zhì)和全氮含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在土壤pH值5.0時最高。

表1 試驗土壤基本理化性質(zhì)

選取飽滿的黑麥草種子，經(jīng)浸種后進行均勻播種，每盆播種40粒，在溫室內(nèi)培養(yǎng)。在播種的第15天進行間苗，每盆留20株長勢良好及大小一致的幼苗。黑麥草生長期間，根據(jù)盆中土壤的干濕狀況進行澆水，使土壤含水量保持在田間持水量的80%，水中未檢出Cd。黑麥草生長期間采用自然光照，晝夜溫度為25℃/20℃，相對濕度66%。每7 d添加1次Hoagland營養(yǎng)液，每次每盆200 ml，同時注意防治病蟲害，拔除盆中雜草。黑麥草在生長90 d時收獲，取樣測定相關(guān)的指標。

1.3 指標測定

(1)種子萌發(fā)指標的測定。每天觀察并記錄黑麥草種子的發(fā)芽情況，待種子萌發(fā)結(jié)束后，計算種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，其計算公式具體如下所示：

發(fā)芽勢=5 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率=10 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)GI=∑(Gt/Dt)

式中:GI為發(fā)芽指數(shù)；Gt為第t日的發(fā)芽種子數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)。

(2)生長生理指標的測定。將植株保持完整取出后分為地上和根部兩部分，用蒸餾水洗凈瀝干水分后測量記錄株高和根長。葉綠素含量采用紫外分光光度法進行測定[17]；根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法進行測定[19]；葉片和根系丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法進行測定[19-20]。將黑麥草樣品放入烘箱中，在105℃殺青15 min，在65℃烘干至恒重，用萬分位電子天平稱重，計算地上生物量、地下生物量和總生物量。根冠比通過地下生物量與地上生物量的比值計算。將采集的新鮮根樣品，迅速投進5%戊二醛的固定液中，抽氣使材料沉底，在4℃冰箱里固定24 h。固定的材料用雙蒸水沖洗，經(jīng)乙醇系列脫水，用環(huán)氧樹脂包埋，用超薄切片機切片，切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，用透射電鏡對黑麥草根細胞的細胞壁、細胞基質(zhì)、線粒體進行觀察及拍片[21-22]。

(3)Cd富集指標的測定。將烘干的黑麥草樣品磨碎過尼龍篩(0.25 mm)，采用HNO3-HClO4法消解；將風干土壤樣品磨碎過0.15 mm篩，采用HNO3-HCl-H2O2消解。消解液中的Cd含量采用原子吸收分光光度法進行測定。黑麥草的Cd富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)根據(jù)如下公式計算：

黑麥草地上部富集系數(shù)=地上部Cd含量/土壤中Cd含量

黑麥草根部富集系數(shù)=根部Cd含量/土壤中Cd含量

黑麥草轉(zhuǎn)運系數(shù)=地上部Cd含量/根部Cd含量

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用R4.0.2對數(shù)據(jù)進行分析。采用雙因素方差分析檢驗土壤酸脅迫、Cd濃度及二者交互作用對黑麥草種子萌發(fā)和生長生理指標的影響，采用Duncan多重比較檢驗法進行不同處理間的差異顯著性檢驗。使用SigmaPlot 14.0作圖。圖表中的數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酸脅迫對黑麥草種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，土壤酸脅迫及其與Cd濃度處理的交互作用對黑麥草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率有極顯著影響(p<0.01)，對種子發(fā)芽指數(shù)無顯著影響(p>0.05)。由圖1可知，當土壤pH值為4.0(Cd0)時，黑麥草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率明顯受到抑制(p<0.05)；隨著土壤pH值升高，種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率表現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在Cd100土壤中，黑麥草種子的發(fā)芽勢在pH值6.0時顯著高于pH值4.0和pH值4.5(p<0.05)；種子發(fā)芽率在pH值5.0時達89.17%，顯著高于其余3種酸處理(p<0.05)(圖1)。

2.2 土壤酸脅迫對黑麥草生長生理的影響

由表2可知，土壤酸脅迫對黑麥草的株高、根長和根冠比有極顯著影響(p<0.01)，土壤酸脅迫及其與Cd濃度處理的交互作用對黑麥草的地上生物量、地下生物量和總生物量存在極顯著影響(p<0.01)。從圖2可以看出，在Cd0土壤中，黑麥草的株高、根長、地上生物量、地下生物量和總生物量隨著土壤pH值的升高呈先升高后降低的趨勢，且在土壤pH值5.0時達到最大，顯著高于pH值4.0(p<0.05)。土壤pH值為5.0(Cd0)時黑麥草的株高、根長、地上生物量、地下生物量和總生物量分別為pH值4.0(Cd0)的1.76倍、2.20倍、1.91倍、2.20倍和2.04倍。在Cd100土壤中，黑麥草的株高、根長、地上生物量、地下生物量和總生物量在pH值4.0時顯著低于其余3種酸處理(p<0.05)(圖2)。表明較高濃度的土壤酸脅迫抑制黑麥草生長。

圖2 土壤酸脅迫對黑麥草生長的影響

表2 土壤酸脅迫、Cd濃度及交互作用對黑麥草種子萌發(fā)和生長生理的影響

注：Cd0和Cd100分別表示Cd濃度為0，100mg/kg；不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)，下同。

土壤酸脅迫及其與Cd濃度處理的交互作用對黑麥草的葉綠素總量、根系活力、葉片丙二醛含量和根系丙二醛含量有極顯著影響(p<0.01)(表2)。由圖3可知，當土壤pH值為4.0時，在Cd0和Cd100土壤中生長的黑麥草的葉綠素總量和根系活力明顯受到抑制(p<0.05)；隨著土壤pH值升高，葉綠素總量和根系活力顯著增加(p<0.05)。相反的，黑麥草葉片和根系的丙二醛含量隨著土壤pH值升高而顯著降低(p<0.05)(圖3)。

圖3 土壤酸脅迫對黑麥草生理特性的影響

土壤酸脅迫破壞黑麥草的根細胞超微結(jié)構(gòu)。透射電鏡下觀察黑麥草根細胞，當土壤pH值為6.0(Cd0)時，細胞壁結(jié)構(gòu)緊密，厚度均勻，細胞膜完整，細胞基質(zhì)呈凝膠態(tài)，線粒體為圓形或橢圓形，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)明顯，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰(圖4A—B)；當土壤pH值降低至4.0(Cd0)時，細胞壁粗細不均，部分細胞壁溶解斷裂，細胞壁內(nèi)側(cè)出現(xiàn)絮狀物，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞明顯，細胞基質(zhì)由凝膠態(tài)向分散碎塊變化，線粒體解體為絮狀物難以辨別(圖4C—D)，表明高濃度的酸脅迫會造成黑麥草根細胞壁和線粒體結(jié)構(gòu)的破壞。

2.3 土壤酸脅迫對黑麥草Cd富集的影響

土壤酸脅迫對黑麥草Cd富集的影響見圖5。在Cd100土壤中，不同土壤酸脅迫下的黑麥草地上部Cd含量為93.74～208.76 mg/kg，根部Cd含量為369.95～827.59 mg/kg，地上部富集系數(shù)為1.20～2.41，根部富集系數(shù)為3.78～9.55，可見植物體內(nèi)不同部位Cd含量和對Cd的富集系數(shù)不同。黑麥草地上部和根部對Cd的富集系數(shù)均大于1，且根部對Cd的富集系數(shù)高于地上部。黑麥草地上部Cd含量、根部Cd含量、地上部富集系數(shù)和根部富集系數(shù)均隨著土壤pH值升高表現(xiàn)出先升高后降低，其在pH值4.5和pH值5.0時顯著高于pH值4.0和pH值6.0(p<0.05)。黑麥草的轉(zhuǎn)運系數(shù)為0.19～0.32，隨著土壤pH值升高顯著降低(p<0.05)。

圖5 土壤酸脅迫對黑麥草Cd富集的影響

3 討 論

發(fā)芽勢反映了種子出苗速度的快慢，發(fā)芽率能夠反映種子生命力的強弱[20]。本研究中黑麥草種子萌發(fā)隨土壤pH值的變化特征表明，較高濃度的土壤酸脅迫(pH值4.0)對黑麥草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率具有明顯抑制作用，而較低濃度的土壤酸脅迫(pH值4.5～6.0)對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率具有一定的促進作用。即黑麥草種子在弱酸性土壤條件下能夠正常萌發(fā)，具有一定的耐酸性，但是在強酸性土壤條件下，種子的萌發(fā)受到了顯著抑制，這與魏禎禎[23]、何影[24]等的研究結(jié)果相似。酸脅迫下黑麥草種子萌發(fā)受到抑制的原因可能是低濃度的酸脅迫可改善胚的生理活性，促進種子萌發(fā)；而高濃度酸脅迫降低種子細胞內(nèi)保護酶活性，抑制種子內(nèi)儲藏物質(zhì)分解與呼吸代謝，從而影響種子萌發(fā)所需的物質(zhì)與能量，對胚根及胚芽等造成損傷[25]。

注：Cw，Cm和M分別表示細胞壁、細胞基質(zhì)和線粒體。

植物生長對土壤酸堿度有一定要求，酸脅迫對植物生長的影響可通過株高、根長、生物量和根冠比等形態(tài)指標直觀地表現(xiàn)出來。在本研究中，黑麥草的株高、根長、地上生物量、地下生物量和總生物量在較高濃度土壤酸脅迫(pH值4.0)下受到明顯的抑制作用。根系是植物吸收養(yǎng)分的主要器官，黑麥草根系的生長抑制和生物量的降低意味著該植物在較高濃度土壤酸脅迫下吸收養(yǎng)分的能力下降，進而對整個植株的生長造成影響。王一鳴等[19]通過對土壤酸脅迫下景天三七生長進行研究發(fā)現(xiàn)，植物的株高和根長隨土壤酸化程度的加劇受到明顯的抑制，這與本研究結(jié)果一致。而項敬銀等[3]對禿瓣杜英生長的研究表明，酸脅迫顯著促進了禿瓣杜英總生物量的積累。試驗結(jié)果表現(xiàn)差異的原因可能是由于不同植物對酸脅迫敏感性的不同。生物量的大小是判定植物耐性的指標之一[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草的根長、地下生物量和根冠比在較低濃度土壤酸脅迫(pH值4.5～6.0)下無顯著差異，且生長良好，說明該植物的根系對土壤酸脅迫具有較強耐性。蒙程等[2]研究了土壤酸脅迫對紫花苜蓿生長的影響，結(jié)果表明較低濃度的酸脅迫對植物的株高和地上生物量影響不顯著，與本研究結(jié)果相似。

土壤酸化嚴重時會使葉綠素含量減少，光合作用減弱，影響植物正常生長。在本研究中，黑麥草的葉綠素總量在較高濃度土壤酸脅迫(pH值4.0)時最低，隨著土壤pH值的升高而顯著增加(p<0.05)。陶巧靜等[27]研究發(fā)現(xiàn)，酸脅迫對植物葉綠素的合成表現(xiàn)出高濃度抑制而低濃度促進的影響，與本研究結(jié)果一致。

但也有研究表明，在植物能夠正常生長的情況下，較高濃度的酸脅迫對植物葉綠素含量具有一定的促進作用[28]。脅迫對植物葉綠素的影響表現(xiàn)在使葉綠素的合成受阻和降解加速兩方面[29]。根系活力的高低直接影響植物的生長。黑麥草的根系活力隨土壤pH值升高的變化趨勢與葉綠素總量的相一致。黑麥草根系活力在較低濃度土壤酸脅迫下較強，這與王一鳴等[19]對景天三七根系活力的研究結(jié)果相同。丙二醛含量的多少可反映植物體細胞膜受損情況[26]。黑麥草葉片和根系的丙二醛含量在土壤pH值4.0時最高，隨著土壤pH值升高呈顯著降低，在pH值5.0時達到最低。說明較高濃度的土壤酸脅迫會使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量丙二醛，細胞膜受損嚴重，影響植物正常生長。陳雪嬌等[30]的研究表明，類蘆丙二醛含量在土壤pH值3.5時顯著增加，與本研究結(jié)果相似。酸脅迫對黑麥草葉綠素總量、根系活力、葉片和根系丙二醛含量的研究表明，該植物對土壤酸脅迫的耐性較強。

膜體系的損傷被認為是造成植物體受損害的根本機制[31]。與較低濃度的土壤酸脅迫(pH值6.0)相比，較高濃度的土壤酸脅迫(pH值4.0)對黑麥草的根細胞超微結(jié)構(gòu)具有破壞作用。當土壤pH值降低至4.0時，細胞壁粗細不均，部分細胞壁發(fā)生溶解斷裂，細胞壁內(nèi)側(cè)出現(xiàn)絮狀物，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞明顯，細胞基質(zhì)由凝膠態(tài)向分散碎塊變化，線粒體解體為絮狀物難以辨別，說明高濃度的酸脅迫對黑麥草根細胞壁和線粒體結(jié)構(gòu)造成損傷，這種損傷是不可逆的，可使植物根系活力和生物量下降，最終將導致植物死亡。錢蓮文等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)，常綠楊在高濃度鋁脅迫下的根冠細胞壁、細胞基質(zhì)、淀粉質(zhì)體和淀粉粒明顯受損，與本研究結(jié)果相似。王一鳴等[32]研究發(fā)現(xiàn)，景天三七在輕度(pH值5.5)和中度(pH值4.6)土壤酸化下葉綠體超微結(jié)構(gòu)完整，在重度(pH值3.4)土壤酸化下葉綠體的結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞。

植物對Cd富集能力的大小是進行Cd污染土壤修復時篩選植物的重要指標之一，植物對Cd富集能力的大小受到土壤pH值的影響。土壤酸化嚴重時會影響著植物根系的生長，而根系形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化反過來會影響根系對Cd吸收，從而影響Cd在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和積累。本研究中，不同土壤酸脅迫下的黑麥草地上部Cd含量高于100 mg/kg(僅pH值6.0除外)，根部Cd含量高達369.95 mg/kg以上，可見該植物在土壤酸脅迫下仍對Cd表現(xiàn)出較強的積累能力。項敬銀等[3]研究表明，禿瓣杜英在酸脅迫下對Cd也具有較強的積累能力。富集系數(shù)被作為評價植物對Cd富集能力的重要指標，富集系數(shù)越高，說明植物對Cd的吸收積累能力就越強，越是有利于植物對Cd污染土壤的修復[33-34]。本研究結(jié)果顯示，不同土壤酸脅迫下的黑麥草地上部和根部對Cd的富集系數(shù)都大于1，表明該植物在土壤酸脅迫下仍對Cd具有較強的富集能力。黑麥草地上部Cd含量、根部Cd含量、地上部富集系數(shù)和根部富集系數(shù)在不同土壤酸脅迫下差異顯著，其在pH值4.5和pH值5.0時要顯著高于pH值4.0和pH值6.0(p<0.05)，說明土壤pH值在適度弱酸性條件下更有利于黑麥草對Cd的富集。黑麥草根部的Cd含量和富集系數(shù)明顯高于地上部，導致轉(zhuǎn)運系數(shù)小于1，這也表明該植物吸收的Cd主要富集在根部，其向植物地上部轉(zhuǎn)運Cd的能力較弱，與其他研究者的結(jié)果相同[3,14,17,21,34-35]。

通過以上分析可發(fā)現(xiàn)，植物對酸脅迫的耐受性存在一定的范圍。研究表明，景天三七能夠適應土壤pH值4.2～6.2的土壤環(huán)境[19]，類蘆可在土壤pH值3.5～5.6條件下正常生長[30]，刨花楠在土壤pH值2.5時仍然能夠生長[29]，可見不同植物生長對酸脅迫的耐受范圍不同。通常，在強酸性土壤條件下仍能夠存活的植物屬于耐酸性植物。黑麥草在土壤pH值4.5～6.0時種子萌發(fā)、植物生長生理及Cd富集能力的各項指標都表現(xiàn)出該植物對土壤酸脅迫具有較強的耐性，在酸性土壤條件下的土壤Cd污染植物修復中具有較大利用潛力。

4 結(jié) 論

(1)黑麥草在土壤pH值4.5～6.0時生長和生理狀況良好，但當土壤pH值降低至4.0時黑麥草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率減小，植物株高、根長、生物量、葉綠素總量和根系活力都降低，根細胞超微結(jié)構(gòu)受損，Cd富集能力受到明顯的抑制。

(2)黑麥草在不同濃度土壤酸脅迫下對Cd的富集能力存在明顯差異，從黑麥草地上部與根部的Cd含量和富集系數(shù)來看，土壤pH值在適度弱酸性(pH值4.5和pH值5.0)條件下更有利于黑麥草對Cd的富集。黑麥草根部對Cd的富集能力大于地上部。