耐釩微生物的分離鑒定及其去釩能力分析

伏媛 李迅 余雪梅 王洪婷 賀敏婕 張杰 彭書明

摘要：：隨著經(jīng)濟的發(fā)展，重金屬污染越來越嚴(yán)重。微生物修復(fù)技術(shù)作為一種新型的修復(fù)方法，越來越受到世界各國的重視，因此尋找可降解重金屬的微生物至關(guān)重要。從四川省攀枝花尾礦堆淤泥浸提液和水樣中篩選獲得2株耐釩菌株，分別命名為PFWT01和PFYN01。通過菌落形態(tài)觀察以及16S rDNA分子鑒定表明，菌株P(guān)FWT01為微桿菌Exiguobacterium sp.;菌株P(guān)FYN01為芽孢桿菌Bacillus sp.。在V5+濃度為0.1 mg/L條件下，高耐釩微生物PFWT01和PFYN01對釩的去除率分別為84.5%和76.9%。試驗結(jié)果表明，2株菌株在釩污染土壤的處理中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：釩污染;耐釩細(xì)菌;形態(tài)觀察;16S rDNA;系統(tǒng)發(fā)育樹;去除率

中圖分類號：S182 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0287-06

收稿日期：2019-05-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：3137070605）;四川省科技計劃（編號：2017SZ0185）;科技部國際科技合作計劃專項（編號：2013DFA21690）。

作者簡介：伏媛（1992—），女，四川成都人，碩士研究生，主要從事礦山環(huán)境生態(tài)治理研究。E-mial：307593291@qq.com.

通信作者：彭書明，博士，副教授，主要從事水土介質(zhì)污染恢復(fù)與治理、退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與治理研究。E-mial：pengshuming06@cdut.cn. ?隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人類活動的日益增強，不可避免地加劇了環(huán)境污染[1]。釩鈦磁鐵礦是含有鐵、釩、鈦、鉻等多種重金屬的共生礦，有很高的綜合利用價值。我國67.56%的釩資源來自釩鈦磁鐵礦[2]。釩的冶煉是環(huán)境中金屬釩污染的重要來源，它作為人體必需的微量元素，具有多方面的生理作用，然而釩同時具有多方面的毒性和危害性[3]。據(jù)報道，釩的毒性作用與金屬釩的價態(tài)、溶解度、攝取的途徑等有關(guān)，價態(tài)越高，毒性越大[4]。除明顯的急性中毒外，它還對人體有生殖毒性、胚胎毒性，可能還有致突變、致畸、致癌等毒性[5-6]。

由于微生物對重金屬具有積累和解毒作用，近年來以凈化有毒金屬污染為目的的生物修復(fù)技術(shù)興起[7]。微生物修復(fù)技術(shù)因其處理費用低、效率高、對環(huán)境影響小等優(yōu)點，受到廣泛的關(guān)注[8-11]。在過去的幾十年里，國內(nèi)外一些研究機構(gòu)在金屬釩的生物效應(yīng)及其環(huán)境地球化學(xué)行為等方面開展了大量研究工作，并取得了一系列的成果[12-13]。這些研究成果是確定釩的環(huán)境行為以及客觀評價釩的生物可利用性和毒理性不可或缺的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為人們有效地控制釩污染提供了科學(xué)依據(jù)。但有關(guān)釩污染生物修復(fù)方面的報道并不多見。

四川省攀枝花市巴關(guān)河礦區(qū)堆礦渣區(qū)位于攀枝花市西部，該礦區(qū)在開采期間，產(chǎn)生大量粉塵、廢水和廢渣，這些廢棄物中含有大量的釩，可通過揚塵、雨水沖刷等途徑擴散到周圍環(huán)境中，致使毗鄰的水資源、農(nóng)田土壤受到嚴(yán)重的重金屬污染。為此，本試驗從四川省攀枝花市巴關(guān)河尾礦堆淤泥浸提液和水樣中篩選高耐釩細(xì)菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化以及分子鑒定等方法，對所篩選到的菌株進(jìn)行初步鑒定，通過釩去除能力試驗來研究它們對釩的去除效果，以期為礦區(qū)釩污染的生態(tài)修復(fù)提供菌種儲備，為耐釩細(xì)菌在金屬釩污水處理中的應(yīng)用提供一定技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、主要試劑和培養(yǎng)基

以采自攀枝花市巴關(guān)河西渣場堆渣區(qū)旁的池塘水樣和淤泥本試驗樣品。水樣和淤泥樣品采集完后立即密封保存，儲存于實驗室4 ℃冰箱中。LB液體（固體）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，加蒸餾水至1 000 mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0（配置LB固體培養(yǎng)基時再加一定量的瓊脂粉），于 121 ℃ 下高壓滅菌20 min。在無菌條件下向LB培養(yǎng)基中加入一定體積偏釩酸銨（NH4VO3）母液，配置成含有一定濃度V5+的培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 耐釩菌株的篩選 將培養(yǎng)基的含釩濃度分別設(shè)置為5、10、20、30 mmol/L，分別吸取2 mL水樣和淤泥上清液，加入到50 mL上述培養(yǎng)基中，對耐受性菌種進(jìn)行馴化。將分別混有水樣和淤泥的液體培養(yǎng)基置于30 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)4 d后，吸取0.5～2.0 mL培養(yǎng)物在新配制的液體培養(yǎng)基中接種，于30 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床上繼續(xù)培養(yǎng)4 d。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間后，觀察LB固體培養(yǎng)基上菌落出現(xiàn)的形態(tài)特征并做好記錄，用接種環(huán)挑取單菌落，以平板劃線法接種到新的培養(yǎng)平板中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。多次重復(fù)上述步驟直到獲得純培養(yǎng)物為止。

1.2.2 菌株的理化性質(zhì)測定 取對數(shù)生長期的所篩選到的菌種做革蘭氏染色試驗，在生物顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征。理化性質(zhì)測定的試驗方法借鑒《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]。

1.2.3 耐釩菌株的鑒定 以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取的細(xì)菌基因組DNA片段為模板，選用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴增，其中正向引物為27F，反向引物為1492R，它們的序列分別為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTTC。反應(yīng)體系：25 μL 2XMix（PCR預(yù)混液）;1 μL 27F（正向引物，10 μmol/L）;1 μL 1492R（反向引物，10 μmol/L）;2 μL DNA模板;加雙蒸水（ddH2O）至50 μL。反應(yīng)步驟：94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，35次循環(huán);72 ℃延伸 10 min。將清潔純化回收后的PCR產(chǎn)物送往北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。將測得的16S rDNA序列結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，并利用基本局域聯(lián)配搜尋工具（Blastn）將菌種的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行同源性比對，對菌株進(jìn)行分子鑒定。采用軟件MEGA 7.0構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 耐釩菌株在不同釩濃度下的生長情況

從-70 ℃冰箱中取出保藏好的菌株將其活化，將菌株接種于已配置好的滅菌的培養(yǎng)基，于30 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。取一定量的種子液轉(zhuǎn)入盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角錐形瓶中，加入一定量的釩溶液，使培養(yǎng)基中最終釩濃度為20 mg/L，每個處理3個重復(fù)，于30 ℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)（每隔4 h取次樣）0、4、8、12、16、…、56、60 h后取樣，使用紫外分光光度計在波長為600 nm處測定吸光值D600 nm，并記錄。以不加釩為對照。

1.4 攀枝花巴關(guān)河西渣場區(qū)采樣樣品釩含量的測定

樣品的pH值測定：配制pH值分別為4.00、686、918的3種不同pH值標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，使用pH計測量樣品的pH值。

樣品消解：取水樣2 mL，加入6 mL濃HNO3 10 min 后加入2 mL的過氧化氫溶液，利用高溫高壓消解泵進(jìn)行消解，將消解后的溶液稀釋到一定倍數(shù)。最后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）檢測樣品釩含量。

1.5 耐釩菌株在不同釩濃度下對釩的去除能力

將90 mL液體培養(yǎng)基裝入250 mL培養(yǎng)瓶中，高溫高壓滅菌后冷卻至不燙手時，在超凈工作臺里取經(jīng)過液體培養(yǎng)基過夜活化的菌液200 μL接入到冷卻的培養(yǎng)瓶中，加入10 mL已過濾滅菌的偏釩酸銨溶液母液（釩離子濃度為1、10、100 mg/L），使得培養(yǎng)基釩離子最終濃度分別為0.1、1.0、10.0 mg/L，這些濃度的設(shè)置是根據(jù)渣場實地釩含量的大概范圍來設(shè)定的。2種菌液各取2 μL，依次加入到濃度為0.1、1.0、10.0 mg/L的液體培養(yǎng)基中，每個濃度做3個重復(fù)，用等體積液體培養(yǎng)基不接菌的空白樣作對照。培養(yǎng)8 d后，吸取5 mL菌液于離心管中，在高速冷凍離心機上10 000 r/min條件下離心 10 min，取上層清液，用HNO3和H2O2進(jìn)行消解，用ICP-MS測定消解液中釩離子含量。按照上述方法進(jìn)一步檢測菌株在不同釩濃度下的去釩率。菌體對釩的去除率（R）按如下公式計算：

R=（C0-C）/C0×100%。

式中：C0為空白培養(yǎng)液釩濃度，mg/L;C為去釩后培養(yǎng)液釩濃度，mg/L。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016處理試驗數(shù)據(jù)并進(jìn)行誤差分析;采用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察及生長情況

2.1.1 耐釩菌株的篩選 通過采用含釩LB固體和液體培養(yǎng)基進(jìn)行馴化培養(yǎng)，從水樣和和池塘淤泥中各篩選出1種對釩具有高耐受性的菌株，分別標(biāo)記為PFWT01和PFYN01。它們能在含釩固體培養(yǎng)基上生長，若繼續(xù)增加培養(yǎng)基含釩濃度，平板不冷凝，2種菌株能在較高濃度的釩固體平板上生長，說明2種菌株具有高耐釩抗釩性能。培養(yǎng)2 d后，2種菌株在固體培養(yǎng)基上的菌落和菌苔出現(xiàn)不同程度的顏色變化（圖1）。在液體培養(yǎng)基中同樣出現(xiàn)變色的現(xiàn)象（圖2）。菌株P(guān)FYN01和PFWT01具有降低釩的價態(tài)從而還原釩的能力，在高濃度釩培養(yǎng)基中，菌株P(guān)FWT01同菌株P(guān)FYN01所觀察到的現(xiàn)象一致，說明菌株P(guān)FWT01、PFYN01均具有還原釩的能力。

2.1.2 菌株P(guān)FWT01的形態(tài)學(xué)特征 在LB培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌株P(guān)FWT01形成不規(guī)則圓形，表面光滑濕潤，菌落中央稍有凸起，邊緣不整齊，質(zhì)地軟，橙黃色，色素不擴散的菌落（圖3-a）。革蘭氏染色后，在顯微鏡下呈紫色，為革蘭氏陽性。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PFWT01為短桿菌，兩端鈍圓（圖3-b）。

2.1.3 菌株P(guān)FYN01的形態(tài)學(xué)特征 在LB培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌株P(guān)FYN01形成近似圓形，表面光滑濕潤，邊緣不整齊，質(zhì)地軟，乳白色，色素不擴散的菌落（圖3-c）。革蘭氏染色后，在顯微鏡下呈紫色，為革蘭氏陽性。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓（圖3-d）。

2.1.4 耐釩菌株的生理生化鑒定 通過對2種菌株生理生化試驗得出，在淀粉水解試驗中，菌株P(guān)FWT01、PFYN01都能使淀粉水解;在甲基紅試驗中，菌株P(guān)FWT01顯陰性，菌株P(guān)FYN01顯陽性;在H2S試驗中，菌株P(guān)FWT01能使培養(yǎng)基產(chǎn)生黑色硫化鉛，而菌株P(guān)FYN01不能;2種菌株都不能水解明膠和油脂;在糖類發(fā)酵試驗中，菌株P(guān)FWT01顯陰性，菌株P(guān)FYN01顯陽性（表1）。

2.1.5 耐釩菌株的分子鑒定 經(jīng)北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，獲得2菌株的16S rDNA序列。采用序列局部相似性查詢系統(tǒng)（BLAST）進(jìn)行序列比對分析，利用生物分析軟件MEGA 7.0構(gòu)建2株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4、圖5）表明，菌株P(guān)FWT01與Exiguobacterium profundum strain B09的親緣關(guān)系較近，同源性為99 %，在進(jìn)化樹中與微小桿菌在同一類群中，它們的親緣關(guān)系最近;菌株P(guān)FYN01與Bacillus sp.L25親緣關(guān)系較近，同源性為99%。

根據(jù)以上形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA序列及系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析結(jié)果可得出，從攀枝花巴關(guān)河西渣場堆渣區(qū)旁池塘水樣中得到的微生物PFWT01可鑒定為微小桿菌Exiguobacterium sp.;從渣場堆渣區(qū)旁池塘淤泥中得到的微生物PFYN01可鑒定為芽孢桿菌Bacillus sp.。

2.2 耐釩菌株在20 mg/L釩濃度下的生長情況

2.2.1 菌株P(guān)FWT01的生長曲線測定 由圖6可知，從對數(shù)期一直到生長穩(wěn)定期前期，菌株P(guān)FWT01在有釩條件下D600 nm大于無釩條件下。菌株在有釩條件下培養(yǎng)44 h時D600 nm最大。菌株在無釩條件下培養(yǎng)48 h時D600 nm最大。說明一定量的重金屬釩對細(xì)菌的生長可能有一定的促進(jìn)作用的;另外可能是由于5價釩轉(zhuǎn)化為4價釩，引起了菌液顏色變化，使得在有釩條件下菌液D600 nm偏大。

2.2.2 菌株P(guān)FYN01的生長曲線測定 從圖7可得出，從對數(shù)期一直到生長穩(wěn)定期開始，菌株P(guān)FYN01在有釩條件下D600 nm值大于無釩條件下。菌株在有釩條件下培養(yǎng)36 h時D600 nm最大。菌株在無釩條件下培養(yǎng)42 h時D600 nm最大。說明一定量的重金屬釩對細(xì)菌的生長可能有一定的促進(jìn)作用的;另外可能是由于5價釩轉(zhuǎn)化為4價釩，引起了菌液顏色變化，使得在有釩條件下菌液D600 nm偏大。

2.3 耐釩微生物的釩去除能力

2.3.1 樣品釩含量 水樣的pH值為8.61，呈堿性，這說明前述培養(yǎng)的菌株適合在堿性條件下生長。如表2所示，渣場淤泥處的釩濃度為0.499 mg/L，渣場邊的池塘水釩濃度為0.106 mg/L。

2.3.2 耐釩菌株在不同釩濃度下對釩的去除能力 如圖8所示，在培養(yǎng)液的釩濃度為 0.1 mg/L 時，2種菌株P(guān)FWT01 、PFYN01對釩去除率的最高，分別為84.5%、76.9%;隨著培養(yǎng)液中釩濃度的升高，菌株對釩去除率逐漸降低;在培養(yǎng)液的釩濃度為10 mg/L時，2菌株對釩的去除率差異不大，分別為32.8%、31.7%;當(dāng)培養(yǎng)液中釩離子濃度為10 mg/L時，菌株P(guān)FWT01對釩的去除率要比PFYN01低，菌株P(guān)FWT01、PFYN01對釩的去除率分別為9.7%、15.0%。

篩選的2種菌株通過間接或直接的氧化作用，在厭氧條件下與乳酸鹽、甲酸鹽和丙酮酸鹽等共同作用，將V5+還原成V4+，并最終形成含V4+的固體沉淀，這與Carpentier等的研究結(jié)果[15]一致。

3 討論與結(jié)論

本試驗從污染水樣和淤泥中篩選出對釩具有較高抗性的菌株P(guān)FWT01和菌株P(guān)FYN01，分別對其進(jìn)行了形態(tài)觀察、16S rDNA測序及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，確定了菌株P(guān)FWT01為微小桿菌，菌株P(guān)FYN01為芽孢桿菌。微小桿菌在分解有機污染物，如農(nóng)藥、石油和偶氮染料等，轉(zhuǎn)化重金屬，根際促生，工業(yè)污水處理等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力[16]。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌通過使Cu、Cd和Pb等以硅酸鹽或氫氧化物形式結(jié)合在其細(xì)胞表面來吸附重金屬[17]。結(jié)合這2種菌在已報道中的研究成果，它們有望用于對土壤和水體的重金屬修復(fù)。

2種菌株在培養(yǎng)基釩含量為0.1 mg/L時對釩的去除率最高，達(dá)到80%左右，隨著培養(yǎng)基釩濃度的升高，去除率逐漸下降;在釩濃度為1.0 mg/L時，2菌株對釩的去除率無明顯差異，分別為32.8 %、31.7%;在釩離子濃度為10.0 mg/L時，菌株P(guān)FWT01、PFYN01對釩的去除率最低，分別為97%、15.0%。試驗結(jié)果說明，不同菌株對釩的去除能力有其適應(yīng)的釩離子濃度范圍，篩選的菌株在釩污染土壤處理中具有良好的應(yīng)用前景。

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