草莓炭疽病拮抗菌SKL108的分離、鑒定及拮抗活性

劉程程 王媛花 張雯婷 儲西平 明亮

摘要：為了尋找優(yōu)質(zhì)高效的生物菌種資源，從森林土壤中分離出175個菌落特征相異的細菌，以草莓炭疽病病原菌為指示菌進行平板對峙試驗，篩選出一株拮抗效果最強的生防菌SKL108，抑菌率高達93.22%。經(jīng)16S rRNA系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)合細胞形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標結(jié)果分析，將該菌株鑒定為薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis）。利用平板對峙培養(yǎng)法研究該菌株的抑菌譜，結(jié)果表明，菌株SKL108對多種病原真菌的生長具有明顯的抑制作用，包括常見的番茄灰葡萄孢菌、水稻立枯絲核菌、小麥禾谷鐮孢菌等。這一研究結(jié)果是薩拉曼卡假單胞菌作為生防菌在農(nóng)業(yè)上的首次報道，也表明該菌株具有開發(fā)成生物菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞：拮抗菌;草莓炭疽病;篩選;薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis）

中圖分類號： S432.1;S436.68+4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0125-05

收稿日期：2019-04-30

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（編號：BK20160567）。

作者簡介：劉程程（1987—），女，江蘇徐州人，碩士，助理研究員，主要從事生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用研究。Tel：（025）84390404;E-mail：626778317@qq.com。

通信作者：明 亮，副研究員，主要從事農(nóng)藥劑型的開發(fā)和應(yīng)用研究。Tel：（025）84390404;E-mail：johnbright1300@163.com。

在自然生態(tài)系統(tǒng)中，農(nóng)作物面臨多種病原菌的侵染威脅，近年來，農(nóng)作物種類和栽培方式多樣化，使得作物病害日趨嚴重。草莓因其口感和營養(yǎng)，越來越受到消費者的歡迎，但草莓病害大量發(fā)生，消費者對草莓上農(nóng)藥殘留更加關(guān)注。近年來，隨著全國范圍內(nèi)設(shè)施草莓的種植面積不斷擴大，空間密閉形成高溫高濕環(huán)境，使草莓炭疽病發(fā)生日益嚴重，造成草莓減產(chǎn)25%～30%[1]。草莓炭疽病在草莓整個生育期都能發(fā)生危害[2-3]，以苗期和移栽期最為嚴重，它是由草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioide）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）等引起的，主要危害匍匐莖和根冠，造成根冠腐爛，最終導(dǎo)致植株萎蔫死亡，已嚴重制約了草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-7]。目前國內(nèi)的防治措施正往生物防治方面發(fā)展，不僅因其環(huán)境友好、對人類健康安全，而且在防病的同時還能提高作物的品質(zhì)和產(chǎn)量[8-9]。關(guān)于草莓炭疽病的生物防治，近年來國內(nèi)外有少量報道，F(xiàn)reeman等利用4種木霉菌的提取物防治草莓、葡萄的炭疽病和灰霉病并取得了良好效果[10];張雪等的研究也證實了木霉菌劑能顯著提高紅顏草莓植株對炭疽病的抗病性[11];魏彩燕等鑒定出1株生防菌生防菌株MT-06對草莓炭疽病的生長抑制率達71.75%[12]。但國內(nèi)的報道都尚在研究階段，暫時還未有產(chǎn)品登記。因此，對草莓炭疽病有拮抗效果的拮抗生防菌亟待開發(fā)。

本研究從南京紫金山森林土壤這一相對原始的生態(tài)環(huán)境中篩選出1株對草莓炭疽病菌有強烈的拮抗效果的生防菌SKL108，經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標結(jié)果分析以及16S rRNA系統(tǒng)進化樹分析，鑒定為薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis），并利用平板對峙培養(yǎng)法研究了SKL108的抑菌譜。這為草莓炭疽病生物防治提供了優(yōu)良的菌種資源，更為假單胞菌屬作為拮抗菌開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物病原菌

草莓炭疽病菌、草莓灰霉?。˙otrytis cinerea）、葡萄潰瘍?。˙otryosphaeria rhodina）病原菌均由江蘇省丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

水稻紋枯?。≧hizoctonia solani）、水稻惡苗病（Gibberella fujikuroi）、水稻稻曲?。║stilaginoidea oryzae）、小麥紋枯病（R. cerealis）、小麥赤霉病（Fusarium graminearum）、小麥全蝕病（Gaeumannomyces graminis）、番茄灰霉病（B. cinerea）病原菌均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

拮抗菌分離采用TSA培養(yǎng)基[13]：胰蛋白胨 15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 30 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.6。

拮抗菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

草莓炭疽病病原菌培養(yǎng)和平板對峙試驗采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.3 生化試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、16S rRNA片段擴增所用的各種酶、marker、dNTPs、buffer等試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 拮抗菌的分離

在南京紫金山森林的0～20 cm土層中隨機選取土壤樣品20份，自然晾干，稱取土壤樣品 10 g/份，混合均勻，稱取混合土樣10 g，倒入三角瓶中，用無菌水定容至100 mL，加入適量滅菌的玻璃珠，置于水平搖床（太倉華美生化儀器廠，THZ-E）160 r/min 振蕩30 min混勻，制成1×10-1 g/mL土壤懸浮液，依次加無菌水稀釋制成10-2～10-5 g/mL濃度梯度的系列土壤懸浮液，取各稀釋液100 μL涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，于30 ℃、12 h下光照培養(yǎng)，2 d后根據(jù)菌落特征挑選出單個菌落，劃線純化3次，純化后的細菌菌株置于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min下培養(yǎng)過夜后4 ℃冰箱保存。

1.5 拮抗菌的篩選

草莓炭疽病菌拮抗細菌初篩和復(fù)篩采用對峙生長法。將各細菌在LB固體培養(yǎng)基上活化，然后分別移入2 mL LB培養(yǎng)液中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，獲得拮抗菌液。將草莓炭疽病菌在PDA固體培養(yǎng)基上活化，沿菌落邊緣用直徑5 mm打孔器打孔，將菌餅置于空白PDA平板中央。培養(yǎng)皿四周呈“十”字形點接拮抗菌液（距培養(yǎng)皿中心 25 mm），每個處理重復(fù)3皿，設(shè)清水對照。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照平板菌落長滿時測量拮抗帶寬，并計算抑菌率[14]。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.6 拮抗菌的鑒定

1.6.1 拮抗菌DNA的提取 將對峙篩選的拮抗菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)過夜，離心培養(yǎng)的菌液，收集菌體，利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA，-20 ℃保存。

1.6.2 16S rRNA基因擴增 將提取好的拮抗細菌DNA進行PCR反應(yīng)，所用引物為16S rRNA通用引物（27F，5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;1492R，5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：10×buffer濃縮反應(yīng)緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP混合物2 μL，MgCl2 2.5 μL，rTaq 0.25 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，模板1 μL，無菌水補齊。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min;95 ℃ 變性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸 10 min。將擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，切膠回收后，送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序得到的堿基序列在GenBank中進行同源序列分析，并用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6.3 拮抗菌的生理生化分析 根據(jù)16S rRNA初步鑒定的菌株種類，參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》選擇所需測定的生理生化項目，測定菌株的生理生化反應(yīng)。

1.7 菌株SKL108抗菌譜測定

采用對峙生長法測定SKL108對9種植物病原真菌的抑制作用。將各病原菌在PDA固體培養(yǎng)基上活化，試驗方法同“1.5”節(jié)，計算SKL108對各病原菌的抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選

本研究從土樣中共分離到175個菌落特征相異的細菌，采用平板對峙培養(yǎng)法測定各細菌對草莓炭疽病病原菌的抑制作用。其中有3個表現(xiàn)為拮抗作用（圖1），將選出的3個拮抗菌株進行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)1個菌株編號為SKL108的生防菌拮抗效果顯著高于另外2個菌株（P<0.05），抑菌率高達93.22%（圖2）。

2.2 菌株SKL108的鑒定

菌株SKL108的細胞形態(tài)和生理生化指標結(jié)果見表1。提取分離出的拮抗菌株SKL108的基因組DNA，用通用引物進行16S rRNA的PCR擴增，電泳檢測得到約1 400 bp長度的片段。將這段序列在GenBank中進行Blast分析，與已有的序列進行同源性比較，并用ClustalX軟件進行多重序列比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株SKL108與薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis） OHA11（HG940537）的

親緣關(guān)系最近，相似度達 99.3%，用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株SKL108鑒定為薩拉曼卡假單胞菌。

2.3 菌株SKL108對10種植物病原真菌的抑制作用

由表2和圖4可見，菌株SKL108對10種供試植物病原真菌均有較強的拮抗作用，其中對水稻惡苗病菌的抑制率最低，為47.2%，對番茄灰霉病菌抑制效果最高，達93.9%，說明其對大部分的病原真菌都有較好的抑制作用，具有較廣的抗菌活性。

3 討論與結(jié)論

草莓炭疽病的防治主要遵循以預(yù)防為主、綜合防治的方法。選育抗病品種防控草莓炭疽病固然是最經(jīng)濟有效的途徑，但由于炭疽病的抗性機理復(fù)雜，導(dǎo)致抗性品種資源缺乏。在大部分地區(qū)，種植戶還是依靠藥劑進行病害防控，但化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致炭疽病菌抗藥性不斷增加，防治效果越來越不理想。韓國興等曾報道，多年連續(xù)使用多菌靈和乙霉威防治草莓炭疽病，導(dǎo)致高抗菌株的比例達90%以上，單劑和兩者的混劑都不宜再推廣應(yīng)用[15]。鑒于化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致的抗性和殘留問題在草莓產(chǎn)業(yè)中越來越受到重視，利用拮抗生防菌防治草莓炭疽病成為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧16]。

假單胞菌屬是土壤中分布最廣的微生物類群之一，也是一種重要的植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）。Haas等證實植物根際假單胞菌應(yīng)用在谷物種子或土壤中可以抑制病原菌的生長[17]，其作用機理主要包括根際營養(yǎng)競爭、分泌降解微生物的酶及抗生作用等。據(jù)

報道，假單胞菌可以產(chǎn)生多種抗生素如2，4-二乙酰基間苯三酚、吩嗪酸、硝吡咯菌素、根菌素、假單胞菌酸等，能大大減輕病原菌對植物的侵染[18]。目前假單胞菌在生物防治領(lǐng)域研究最為深入的是熒光假單胞菌（P. fluorescens），它產(chǎn)生的噬鐵素能促進植物生長的同時抑制植物病害的發(fā)生。除噬鐵素外，它還能夠產(chǎn)生十幾種抗生性次級代謝產(chǎn)物，在生防菌劑的開發(fā)及應(yīng)用方面具有巨大的潛力[19-20]。

本研究從相對原始的森林土壤中分離篩選出1株對草莓膠孢炭疽菌有強烈抑制效果的拮抗生防菌SKL108菌株，經(jīng)細胞形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rRNA系統(tǒng)進化樹分析等，鑒定該菌株為假單胞菌屬，與熒光假單胞菌有很高的親緣關(guān)系。菌株SKL108發(fā)酵液對草莓炭疽病的抑制率高達 93.2%，且抑菌譜較廣。這一研究結(jié)果為開發(fā)高效安全的生防菌劑拓寬了研究方向，也提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源。盡管室內(nèi)生物測定試驗中菌株SKL108抑菌作用效果明顯，但還須要進行大量的實踐工作才能明確抑菌作用機理和田間試驗防治效果。因此，下一步的研究重點是初步篩選菌株SKL108的初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，同時明確田間防效，以期開發(fā)出優(yōu)質(zhì)高效的生物菌劑。

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