佛甲草醇提物對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

曹性玲，吳麗珍，麻海娟，曾麗梅，周 青

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種病因不明的全身性自身免疫性疾病，以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣?，多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及功能障礙，致殘率高。 目前臨床用于治療RA的藥物主要以非甾類(lèi)抗炎藥、激素和細(xì)胞毒類(lèi)藥物等西藥為主，這些藥物往往毒副作用大，可造成肝腎損害、骨髓抑制、高血壓等，并且這些藥物的免疫抑制作用會(huì)使人體正常的免疫功能大大降低，從而使患者易患各種感染性疾病。因此總體來(lái)說(shuō)療效并不是很理想，患者經(jīng)常很難堅(jiān)持用藥，使得治愈率很低[1]。

應(yīng)用中醫(yī)藥治療RA的歷史很長(zhǎng)并具有實(shí)際療效，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、改善血液流變性和微循環(huán)、抗自由基損傷、調(diào)控細(xì)胞因子等有關(guān)[2-3]。中醫(yī)藥不僅來(lái)源廣泛、毒副反應(yīng)小，而且具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)綜合作用的特點(diǎn)，從中尋找具有優(yōu)良抗RA活性的有效成分現(xiàn)已成為藥物研發(fā)的重要途徑。佛甲草(Sedum Lineare Thunb, SLT)為《中藥大辭典》收載的中藥材，是景天科植物佛甲草的全草，味甘、寒、無(wú)毒，具有清熱、解毒、消腫、利膽等功效，傳統(tǒng)中醫(yī)用于咽喉腫痛、癰腫、疔瘡、燙傷、蛇咬傷、痢疾、黃疸等。本課題組前期研究結(jié)果表明，佛甲草可顯著降低急性和慢性炎癥反應(yīng)，并對(duì)免疫功能具有調(diào)節(jié)[4]。在佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠動(dòng)物模型上，可以觀(guān)察到佛甲草醇提物通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能、減少炎性細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的生成，抑制急性和繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎，降低脾臟指數(shù)。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探究SLT對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的作用，觀(guān)察其對(duì)細(xì)胞炎性因子及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響，以推測(cè)SLT治療AA的機(jī)制。為將佛甲草開(kāi)發(fā)為治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效藥物提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物佛甲草醇提物：佛甲草曬干后粉碎至粗粉，取適量蒸餾水加熱提取3次，每次30 min，過(guò)濾，合并3次濾液并濃縮至適量，加入相當(dāng)濃縮液3倍量95%乙醇，放置冰箱48 h后減壓過(guò)濾，濾液回收乙醇至無(wú)醇味并濃縮成2.5 g·mL-1的溶液，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水稀釋至所需濃度供用；雷公藤多苷片(Tripterygium wilfordii glycosides tablet, TPT)，黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20101001。

1.2動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重(180±20) g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證書(shū)編號(hào)：SCXK(湘)2016-0004。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.3試劑完全弗氏佐劑(complete freund's adjuvant, CFA)，Sigma公司，貨號(hào)：129K8700；β-actin一抗(Ta-09)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG(ZB-2303)及山羊抗鼠lgG(ZB-2305)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IL-1β(sc-7884)、IL-17(sc-374218)、IL-10(sc-365858)、NF-κB(sc-114)一抗，Santa Cruz公司；α7nAChR(ab23832)和TNF-α(ab66579)一抗，Abcam公司；BSA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京天根生化科技有限公司(J8830/M2114)；HRP化學(xué)發(fā)光試劑盒，美國(guó)賽默飛世爾科技公司(1856135/1856136)。

1.4方法

1.4.1分組、動(dòng)物模型制備及給藥24只SD大鼠，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組、4 g·kg-1佛甲草醇提物治療組，8只/組。各組大鼠左后足常規(guī)消毒后，于足底皮下注射0.1 mL CFA致炎，正常對(duì)照組注射0.1 mL生理鹽水。第7 d加強(qiáng)一針，復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。從造模前3 d一直到造模后的第16 d，各組分別給予佛甲草醇提物和等量的生理鹽水，ig，1次/d。

1.4.2 Westernblot方法檢測(cè)脾臟組織中蛋白表達(dá)水平取20 mg脾臟組織于1.5 mL離心管中，加入200 μL裂解液，搗碎后，再加入400 μL裂解液，置于4 ℃顛倒混勻1 h。12 000×g，4 ℃，離心5 min。取上清液BCA法行蛋白定量。總蛋白50 μg，加緩沖液， 95 ℃，5 min，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離。將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，加3%～5%的牛奶，封閉1 h。不同的膜分別TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10、NF-κB和a7nAChR一抗孵育，4 ℃過(guò)夜。二抗室溫孵育1 h。將化學(xué)發(fā)光試劑盒中的兩種試劑按1∶1比例混合，混勻后，在暗室中與硝酸纖維素膜搖動(dòng)孵育1 min，于超高靈敏度化學(xué)成像發(fā)光儀照相，儀器自帶軟件測(cè)定各條帶灰度值，與相應(yīng)的內(nèi)參比較后，將正常組值定為1，計(jì)算其余組相對(duì)值。

2 結(jié) 果

2.1佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟NF-κB及細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響如圖1～7所示，與正常對(duì)照組比較，佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠脾臟TNF-α(P<0.001)、IL-1β(P<0.01)、IL-17(P<0.05)及NF-κB(P<0.05)蛋白表達(dá)升高，a7nAChR(P<0.05)表達(dá)降低，IL-10(P<0.01)表達(dá)變化不明顯；與模型組比較，4 g·kg-1SLT治療組TNF-α(P<0.01)、IL-1β(P<0.05)、IL-17(P<0.05)及NF-κB(P<0.05)蛋白表達(dá)降低，IL-10(P<0.01)及a7nAChR(P<0.01)表達(dá)升高。

圖1 佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟NF-κB及細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響

圖2 佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟TNF-α的影響

注：F=16.963，P=0.000 9，正常組與模型組比較：q=6.793，***P<0.001；治療組與模型組比較：q=7.431，##P<0.01。

圖3 佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟IL-1β的影響

注：F=11.391，P=0.003 4，正常組與模型組比較：q=6.749，**P<0.01；治療組與模型組比較：q=3.485，#P<0.05。

圖4 佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟IL-17的影響

注：F=8.846，P=0.012 1，正常組與模型組比較：q=5.554，*P<0.05；治療組與模型組比較：q=4.770，#P<0.05。

圖5 佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟IL-10的影響

注：F=15.740，P=0.000 8，正常組與模型組比較：q=0.271，P>0.05；治療組與模型組比較：q=6.596，##P<0.01。

圖6 佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟NF-κB的影響

注：F=5.890，P=0.018 2，正常組與模型組比較：q=4.667，*P<0.05；治療組與模型組比較：q=3.701，#P<0.05。

圖7 佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠脾臟a7nAChR的影響

注：F=18.185，P=0.002 8，正常組與模型組比較：q=3.539，*P<0.05；治療組與模型組比較：q=8.490，##P<0.01。

3 討 論

RA是臨床上常見(jiàn)的慢性、炎癥性、漸進(jìn)性的自身免疫性疾病，目前尚無(wú)有效的治療方法。它的病變特征主要有滑膜炎以及關(guān)節(jié)腔內(nèi)血管內(nèi)皮生成，可導(dǎo)致多關(guān)節(jié)、對(duì)稱(chēng)的侵入性炎癥，使得骨軟骨損傷、關(guān)節(jié)被破壞以及關(guān)節(jié)畸形[5]，甚至還可導(dǎo)致多器官損傷[6-7]。因此，治療RA首先要減少炎癥反應(yīng)。大鼠AA模型的臨床表現(xiàn)、病理變化等與人類(lèi)RA非常相似，是常用的一種免疫性炎癥模型。我們前期研究發(fā)現(xiàn)AA大鼠模型組原發(fā)性、繼發(fā)性足腫脹非常明顯，佛甲草醇提物(4, 8 g·kg-1)能明顯抑制AA大鼠原、繼發(fā)性足跖腫脹程度，對(duì)大鼠AA有明顯改善作用。

迄今，RA的病因還不太明確，有研究顯示，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的失平衡在RA的發(fā)病中有顯著作用[8-9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，SLT顯著降低AA大鼠血清TNF-α、IL-6水平及關(guān)節(jié)液PGE2含量，降低脾臟指數(shù)。提示SLT可調(diào)控AA發(fā)病時(shí)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)，脾臟參與其中。

NF-кB在正常情況下位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，以p65/p50異源二聚體形式存在，在靜息狀態(tài)下，NF-кB與其天然性抑制因子IкB結(jié)合在一起形成復(fù)合物，IкB阻止NF-кB進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)的靶基因。NF-кB信號(hào)通路參與多種免疫炎癥的調(diào)節(jié)[10]。有研究表明NF-кB與炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)之間具有相互作用，可彼此激活、調(diào)控[11-12]，這兩者的共同作用可使得炎癥加劇。當(dāng)減少NF-κB的表達(dá)時(shí)，RA的癥狀可顯著減輕[13-15]。 因此抑制NF-кB及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)是治療RA的一個(gè)重要切入點(diǎn)[16-17]。

α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholiner receptor, α7nAChR) 由同源五聚體所組成，屬于神經(jīng)元型乙酰膽堿受體，是一種配體門(mén)控離子通道，在膽堿能抗炎通路(Cholinergic Anti-Inflammatory Pathway，CAP)中發(fā)揮重要作用。膽堿能抗炎通路是神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路中的一種，在全身炎癥反應(yīng)中有重要作用，可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)揮作用[18-22]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，佛甲草醇提物(4 g·kg-1)可明顯降低AA大鼠脾臟組織中NF-кB p50的表達(dá)，同時(shí)TNF-α、IL-1β、IL-17等促炎細(xì)胞因子表達(dá)降低，抑炎細(xì)胞因子IL-10及α7nAChR表達(dá)升高。由此推測(cè)佛甲草醇提物對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥的治療作用可能與抑制NF-κB信號(hào)通路、激活膽堿能抗炎通路、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡有關(guān)。