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    低濃度苯和甲醛經(jīng)呼吸道聯(lián)合染毒對(duì)小鼠肝臟毒性研究

    2020-07-06 09:56:44鄒麗君高艷芳胡恭華
    關(guān)鍵詞:染毒甲醛低劑量

    鄒麗君,張 娟,高艷芳,胡恭華

    (贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,江西 贛州 341000)

    苯和甲醛是典型的職業(yè)環(huán)境污染物和室內(nèi)空氣污染物[1],引發(fā)的健康問題也成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。苯和甲醛均是人類確認(rèn)的致癌物,兩種毒物長(zhǎng)期高濃度接觸可導(dǎo)致肝腎、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多種健康損害[2-4],目前的研究多集中于苯和甲醛各自的健康損害及相關(guān)機(jī)制,兩種毒物的聯(lián)合作用且低濃度、短時(shí)間的毒性作用研究較少,本文擬通過對(duì)ICR小鼠進(jìn)行苯和甲醛低濃度、短時(shí)間的聯(lián)合暴露來探討肝臟毒性,為相關(guān)研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性ICR小鼠54只,平均體重26.56 g[購自湖南斯克景達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002,使用許可證編號(hào)SYXK(贛)2018-0004]。屏障環(huán)境飼養(yǎng)和染毒,溫度18~24 ℃,濕度為40%~60%。

    1.2儀器和試劑55 L靜式染毒柜(實(shí)驗(yàn)室自制,塑料材質(zhì)、可密封、透明),Sorvall ST 8R型高速冷凍式離心機(jī)(美國Thermo Fisher),EON-EPOCH酶標(biāo)儀(美國Biotek),ZXDP-R2800電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海智城),玻璃勻漿器;苯(分析純,國藥集團(tuán)),37%甲醛水溶液(分析純,國藥集團(tuán)),0.01 M PBS緩存液,CHO測(cè)試盒、TG測(cè)試盒、ALT測(cè)試盒、AST測(cè)試盒、SOD測(cè)試盒和MDA測(cè)試盒(南京建成)。

    1.3實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1分組和染毒54只SPF級(jí)雌性ICR小鼠隨機(jī)分組均分9組,依次分為G1(空白對(duì)照組)、G2(低苯組,苯劑量12 mg·m-3)、G3(高苯組,苯劑量60 mg·m-3)、G4(低甲醛組,甲醛劑量2 mg·m-3)、G5(高甲醛組,甲醛劑量10 mg·m-3)、G6(低苯+低甲醛組,苯劑量12 mg·m-3+甲醛劑量2 mg·m-3)、G7(高苯+低甲醛組,苯劑量60 mg·m-3+甲醛劑量2 mg·m-3)、G8(低苯+高甲醛組,苯劑量12 mg·m-3+甲醛劑量10 mg·m-3)、G9(高苯+高甲醛組,苯劑量60 mg·m-3+甲醛劑量10 mg·m-3),每組6只,呼吸道靜式染毒,連續(xù)染毒14天,2小時(shí)/天(中間間隔一小時(shí))。染毒期間禁食禁水,其余時(shí)間自由飲水?dāng)z食,每7天測(cè)量一次體重。

    1.3.2血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定染毒結(jié)束,10%水合氯醛麻醉小鼠后摘眼球取血,5分鐘2 000 rmp離心分離血清,按照試劑盒的說明書測(cè)定和計(jì)算ALT和AST。

    1.3.3肝臟組織超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量測(cè)定染毒結(jié)束處死小鼠,解剖分離肝臟,稱量約0.1 g肝臟組織與PBS緩沖液按1∶9用玻璃勻漿器制備10%肝勻漿,10分鐘3 000 rmp離心,取上清液按照試劑盒說明書測(cè)定和計(jì)算測(cè)定肝臟組織SOD活力和MDA含量。

    1.3.4血清總膽固醇(CHO)和血清甘油三酯(TG)測(cè)定染毒結(jié)束,10%水合氯醛麻醉小鼠后摘眼球取血,5分鐘2 000 rmp離心分離血清,按照試劑盒說明書測(cè)定和計(jì)算CHO和TG。

    2 結(jié) 果

    2.1苯和甲醛聯(lián)合染毒14天小鼠體重變化情況苯不同劑量組小鼠體重增長(zhǎng)不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),甲醛不同劑量組的體重增長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量越高增長(zhǎng)越緩慢趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)有交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

    表1 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天小鼠體重變化情況

    表2 各組小鼠體重增長(zhǎng)的方差分析結(jié)果

    2.2苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對(duì)小鼠ALT和AST的影響各處理組的ALT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,無主效應(yīng)及交互作用;而AST無主效應(yīng)但呈現(xiàn)交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、4。

    表3 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對(duì)小鼠ALT和AST的影響

    表4 各組小鼠ALT、AST方差分析結(jié)果

    2.3苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對(duì)小鼠SOD活力和MDA含量的影響各處理組的肝組織SOD活力隨染毒劑量增加有下調(diào)趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;苯不同劑量組MDA含量不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),甲醛不同劑量組MDA含量不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5、6。

    表5 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對(duì)小鼠SOD活力和MDA含量的影響

    表6 各組小鼠SOD活力、MDA含量方差分析結(jié)果

    2.4苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對(duì)小鼠CHO和TG的影響各處理組的CHO差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,無主效應(yīng)及交互作用。苯不同劑量組TG不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),甲醛不同劑量組TG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)TG有交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7、8。

    表7 苯和甲醛聯(lián)合染毒14天對(duì)小鼠CHO和TG的影響

    表8 各組小鼠CHO、TG方差分析結(jié)果

    3 討 論

    苯和甲醛作為人類確認(rèn)的致癌物和致突變物,經(jīng)常聯(lián)合暴露于職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)空氣環(huán)境,如化工行業(yè)中用于原料生產(chǎn)各類化工產(chǎn)品、作為溶劑和助劑用于噴漆印刷行業(yè)和家居裝修材料等。隨著國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的推廣實(shí)施,職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)空氣環(huán)境中兩者的暴露通常在較低的水平,在這種情況下,兩者是否存在聯(lián)合作用、其健康損害呈現(xiàn)何種特征是一個(gè)新的命題。根據(jù)我國職業(yè)接觸限值苯(PC-STEL:10 mg·m-3)及甲醛(MAC:0.5 mg·m-3)[5],我們將本次苯和甲醛經(jīng)呼吸道染毒的劑量分別設(shè)置為0、12、60 mg·m-3和0、2、10 mg·m-3,按兩因素三水平的析因設(shè)計(jì)組合為9個(gè)不同染毒劑量組,對(duì)ICR小鼠進(jìn)行14天單獨(dú)染毒與聯(lián)合染毒(2 h/天),基本符合低濃度、短時(shí)間的聯(lián)合暴露。

    從染毒期間小鼠體重變化的析因分析結(jié)果來看,苯不同劑量組小鼠體重增長(zhǎng)不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),甲醛不同劑量組的體重增長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量越高增長(zhǎng)越緩慢趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明該劑量下的苯對(duì)小鼠體重的影響要高于甲醛,苯和甲醛聯(lián)合吸入染毒對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)有交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組體重增長(zhǎng)較少,高劑量聯(lián)合組體重增長(zhǎng)較多,說明該劑量下的苯對(duì)小鼠體重的影響要高于甲醛,聯(lián)合染毒時(shí)甲醛的暴露抵消了苯對(duì)體重的影響。肝臟是機(jī)體最大的代謝器官,肝功能的變化可以表征毒物的毒作用特點(diǎn)并為毒作用機(jī)制研究提供線索。ALT和AST這兩種轉(zhuǎn)氨酶是代表肝功能的生物標(biāo)志物,ALT主要集中在肝臟,AST分布更廣泛,轉(zhuǎn)氨酶的升高說明肝功能可能發(fā)生損傷。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各處理組的ALT變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而苯和甲醛對(duì)AST呈現(xiàn)交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高劑量聯(lián)合染毒組AST水平較低,提示該劑量下的AST變化可能來自于肝臟或者其他系統(tǒng)的損傷,且聯(lián)合暴露的效應(yīng)與單獨(dú)暴露不同。SOD 是抗氧化系統(tǒng)中重要的酶類, 能特異地捕獲體內(nèi)生成的 O2-·,MDA 是脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物, 是機(jī)體氧化損傷的標(biāo)志物,已有研究證實(shí)苯與甲醛單獨(dú)染毒或聯(lián)合染毒在多種器官中都能發(fā)現(xiàn)SOD活力和MDA含量的變化,并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系[6-7]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各處理組的肝臟SOD活力隨染毒劑量增加有下調(diào)趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;苯不同劑量組MDA含量不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),甲醛不同劑量組MDA含量不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),低劑量聯(lián)合染毒組MDA含量升高,高劑量聯(lián)合染毒MDA含量降低,且聯(lián)合染毒各組均高于單獨(dú)染毒。各處理組的SOD變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異說明該劑量下動(dòng)物的抗氧化酶類還沒有顯著性改變,但MDA的結(jié)果說明該劑量下的苯和甲醛的暴露已出現(xiàn)肝臟氧化損傷,且聯(lián)合毒性更大,存在交互作用,結(jié)合其他相關(guān)文獻(xiàn)來看[8-9],在劑量更高、時(shí)間更長(zhǎng)的情況下,抗氧化酶類和氧化反應(yīng)產(chǎn)物都有顯著性改變,提示低劑量下氧化反應(yīng)產(chǎn)物變化可能早于抗氧化酶類,表現(xiàn)更靈敏。內(nèi)源性血脂主要是在機(jī)體的肝臟、脂肪等組織細(xì)胞合成,血脂作為評(píng)價(jià)脂代謝功能的重要指標(biāo),可以反映肝臟的代謝功能。從本次實(shí)驗(yàn)的血脂結(jié)果來看,各處理組的CHO差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,無主效應(yīng)及交互作用。TG表現(xiàn)為苯不同劑量組變化不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),甲醛不同劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),低劑量聯(lián)合染毒顯示TG升高較明顯,但各聯(lián)合染毒組均低于低劑量苯組,說明該劑量下的苯對(duì)小鼠TG的影響要高于甲醛,聯(lián)合染毒時(shí)甲醛的暴露抵消了苯對(duì)TG的影響。

    綜上所述,低濃度、短時(shí)間的苯和甲醛聯(lián)合暴露對(duì)ICR小鼠的體重增長(zhǎng)有影響,存在系統(tǒng)毒性,結(jié)合AST、TG、MDA的變化來看,可以推測(cè)該劑量下的暴露可導(dǎo)致肝臟等多種臟器的損傷。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,苯的肝臟毒性更明顯,多個(gè)指標(biāo)在苯不同劑量組有差異,提示目前苯的PC-STEL值接近健康損害閾值,存在一定風(fēng)險(xiǎn)。苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用,表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合毒效應(yīng)增強(qiáng),高劑量聯(lián)合毒效應(yīng)降低,有可能是低劑量的聯(lián)合暴露導(dǎo)致動(dòng)物的低劑量保護(hù)效應(yīng),各項(xiàng)指標(biāo)都代償性升高,但考慮到樣本量和實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性,其交互作用具體為拮抗還是協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。

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