丹參多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)分析及質(zhì)量控制研究進(jìn)展

王非凡 馬云鳳 景永帥

河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，石家莊，050018，中國

丹參是唇形科植物丹參（salvia miltiorrhiza Bunge.）的干燥根和根莖，因其良好的活血祛瘀功效，又被稱為活血丹、血參等［1］。目前，國內(nèi)外在丹參制劑中的開發(fā)和應(yīng)用主要集中在酚酸類和丹參酮類［2］，而丹參多糖（salvia miltiorrhizapolysaccharide，SMP）作為丹參中含量最高的活性物質(zhì)，也越發(fā)受到研究者們的關(guān)注。研究表明丹參多糖具有抗氧化［3］、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤［4］、保護(hù)心肌細(xì)胞［5］、保護(hù)肝臟［6］等多種生物活性。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系，關(guān)于活性多糖的結(jié)構(gòu)分析和質(zhì)量控制的相關(guān)研究已成為目前研究熱點(diǎn)內(nèi)容之一［7］。丹參多糖結(jié)構(gòu)研究主要涉及單糖組成、糖苷鍵類型、分子量大小等內(nèi)容。丹參多糖由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大，導(dǎo)致其分離純化、結(jié)構(gòu)分析以及藥理作用機(jī)制研究等工作進(jìn)展較緩慢，因此有必要對(duì)提取的丹參多糖進(jìn)行質(zhì)量控制，提高丹參多糖的質(zhì)量穩(wěn)定性和可控性。

現(xiàn)有丹參的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要集中在多酚酸鹽、丹參酮等含量測(cè)定上，而對(duì)于多糖等活性成分的含量卻未做規(guī)定。丹參多糖在丹參藥材中含量最高，藥理作用豐富，是其發(fā)揮生物活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，后續(xù)有必要將丹參多糖作為質(zhì)量控制指標(biāo)之一。本文主要從丹參多糖提取方法、結(jié)構(gòu)分析、藥理作用和質(zhì)量控制等方面進(jìn)行綜述，以期為丹參多糖及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐和參考依據(jù)。

1 提取方法

溶液浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶輔助提取法等是目前中藥多糖提取過程中常見方法［8］。目前報(bào)道的丹參多糖主要提取方法和結(jié)果見Tab.1，其中超聲提取法可減少提取時(shí)間、提高多糖提取率，通常也作為提取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的方法之一；酶法作為常用提取方法之一，主要通過降解植物細(xì)胞壁以提高多糖提取率。

Tab.1 Optimized results of SMP extraction process

2 丹參多糖結(jié)構(gòu)分析

多糖結(jié)構(gòu)決定多糖性質(zhì)，已報(bào)道的丹參多糖結(jié)構(gòu)分析主要包括其單糖組成、分子量大小、糖苷鍵連接方式等內(nèi)容。

2.1 丹參多糖的單糖組成

由于多糖沒有共軛體系，無紫外吸收，因此在采用儀器分析方法測(cè)定多糖組成時(shí)通常先將多糖水解為單糖，之后用衍生化試劑進(jìn)行衍生化處理。單糖組成測(cè)定常用方式有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜法（gas chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）和毛細(xì)管電泳法（high performance capillary electrophoresis，HPCE）等方法。前人報(bào)道丹參多糖的單糖組成結(jié)果見Tab.2，由以上數(shù)據(jù)匯總可知，丹參多糖主要是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等單糖組成。

Tab.2 Monosaccharide composition and characterization method of SMP

2.2 丹參多糖分子量測(cè)定

丹參多糖分子量測(cè)定主要采用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）和高效凝膠滲透色譜法（high performence gel permeation chromatography，HPGPC）等。Wang 等［23］用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100 柱對(duì)丹參多糖進(jìn)行分離純化，用HPGPC 法測(cè)定丹參多糖分子量結(jié)果為43 KDa。Jiang等［24］用DEAE -Sepharose CL-6B 柱和Sephadex G-100柱對(duì)丹參多糖進(jìn)行分離純化，用GPC 法測(cè)定丹參多糖分子量結(jié)果為5.27×105Da。

2.3 丹參多糖糖苷鍵連接方式

多糖的糖苷鍵連接方式會(huì)影響其在溶液中的形態(tài)，是影響其生物活性的重要因素之一，因此多糖糖苷鍵連接方式是表征多糖生物活性的重要指標(biāo)之一。目前，對(duì)丹參多糖的結(jié)構(gòu)研究主要集中在其初級(jí)結(jié)構(gòu)。傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）、核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）等儀器可用于測(cè)定多糖的糖苷鍵連接方式。FT-IR 法操作較為簡單，常用于簡單推測(cè)多糖中的官能團(tuán)和糖苷鍵，但結(jié)果較為片面，需結(jié)合其他分析手段對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面分析；NMR 法和GC-MS 法能較為精準(zhǔn)地獲得多糖的糖苷鍵連接方式，是目前確定糖苷鍵連接方式的常用方法。其中2D-NMR 技術(shù)使難以辨認(rèn)的信號(hào)得到確認(rèn)，從而得到多糖分子的構(gòu)型信息。GC-MS 法需將多糖糖苷鏈甲基化后進(jìn)行酸水解，再采用GC-MS 測(cè)定丹參多糖糖苷鍵連接方式。目前多糖糖苷鍵連接方式測(cè)定方法見Tab.3。由Tab.3 得知丹參多糖糖苷鍵連接方式既有（1→6）-α-D-Glc 又有（1→6）-β-D-Glc。

Tab.3 Glycoside linkage method and characterization method of SMP

3 丹參多糖的藥理作用

3.1 抗氧化作用

人體衰老是由于體內(nèi)自由基發(fā)生了氧化反應(yīng)，丹參多糖具有抗氧化作用，可以阻斷自由基被氧化的過程。劉振亮等［28］從丹參多糖對(duì)亞油酸過氧化的抑制作用和還原力兩個(gè)方面評(píng)價(jià)了白花丹參多糖的抗氧化能力，其抑制率和還原力均隨質(zhì)量濃度的增加而升高。陳凌霆等［29］通過超聲輔助加熱法制取丹參多糖，經(jīng)過脫色除雜后，得到丹參精制多糖（SP），再經(jīng)過分離純化得到4 種多糖（SP0、SP1、SP2 和SP3），丹參精制多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最高能到78.89%，SP0對(duì)羥基自由基的清除率較高，為74.27%。丹參多糖可通過清除羥基、超氧陰離子等自由基發(fā)揮抗氧化作用。

3.2 抗癌作用

癌癥是死亡率相對(duì)較高的一類疾病，由于癌細(xì)胞易擴(kuò)散、發(fā)病機(jī)制多樣，導(dǎo)致治療過程漫長且難以痊愈。目前臨床上治療癌癥主要依靠藥物殺死癌變細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)損傷人體正常細(xì)胞，因此尋找低毒、高效的抗癌藥物是醫(yī)藥事業(yè)的重要任務(wù)之一。Liu 等［4］研究發(fā)現(xiàn)丹參多糖具有抑制肝癌H22 細(xì)胞增殖的作用，可起到抗癌效果。Wang 等［23］研究發(fā)現(xiàn)丹參多糖溶液可以增加胃癌小鼠的免疫器官指數(shù)，抑制細(xì)胞內(nèi)促炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，可用于治療胃癌。丹參多糖可通過抑制癌細(xì)胞增殖和提高免疫力等途徑發(fā)揮抗癌作用。

3.3 保護(hù)肝臟

肝損傷主要是指肝細(xì)胞損傷，是多種肝臟疾病共有的病變結(jié)果。大量研究表明多糖具有防治和改善化學(xué)性肝損傷和免疫性肝損傷的作用［18］。近年來丹參多糖也已經(jīng)應(yīng)用到肝病的治療中，用于改善肝功能。Sun等［6］發(fā)現(xiàn)丹參多糖能夠上調(diào)PRDX6、抑制脂質(zhì)過氧化并促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達(dá)，從而抑制核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活性，最終達(dá)到預(yù)防免疫性肝損傷的作用。宋雨鴻等［30］研究發(fā)現(xiàn)丹參多糖可以明顯改善肝損傷模型小鼠的肝臟指數(shù)，具有抗免疫性肝損傷的作用。丹參多糖可通過抗自由基損傷和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

3.4 保護(hù)心肌細(xì)胞

心肌細(xì)胞損傷容易導(dǎo)致多器官衰竭。張建成等［31］研究發(fā)現(xiàn)脂多糖誘導(dǎo)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌損傷加重。丹參多糖通過增強(qiáng)自噬抑制脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其作用機(jī)制為丹參多糖使凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和Cleavedcaspase3 表達(dá)量減少，自噬相關(guān)蛋白Beclin1 和LC3II蛋白表達(dá)量增加。Song 等［16］研究發(fā)現(xiàn)丹參多糖能通過改善氧化應(yīng)激和抑制心肌細(xì)胞凋亡達(dá)到預(yù)防心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）誘導(dǎo)的心肌梗死。綜上可知，丹參多糖可通過促進(jìn)自噬、改善氧化應(yīng)激及抑制心肌細(xì)胞凋亡等發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

4 質(zhì)量控制

通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前丹參多糖研究主要集中于結(jié)構(gòu)測(cè)定方面，尚無關(guān)于丹參多糖質(zhì)量控制的系統(tǒng)研究。中藥指紋圖譜指通過對(duì)中藥材或中成藥進(jìn)行適當(dāng)處理，采用一定的分析方法，得到能夠標(biāo)志該中藥材或中成藥的特征色譜或光譜的圖譜，旨在通過這一技術(shù)反映具有復(fù)雜成分的中藥材所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥質(zhì)量。世界衛(wèi)生組織在有關(guān)中草藥評(píng)價(jià)中也明確提出，在中草藥活性成分不明的情況下，可以提供其色譜指紋圖譜來證明該產(chǎn)品的質(zhì)量。例如，胡明華等［32］建立了可可粉多糖的高效液相色譜指紋圖譜，通過對(duì)其中甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖色譜峰的分析，發(fā)現(xiàn)不同來源多糖樣品具有高度相似性，能夠?qū)煽煞鄱嗵羌跋嚓P(guān)產(chǎn)品進(jìn)行摻假檢測(cè)。Li等［33］建立不同產(chǎn)地草珊瑚多糖的凝膠滲透色譜指紋圖譜，結(jié)果表明18 批樣品圖譜相似，具有同一主要特征峰，圖譜差別不大，分子量分布范圍為1 791.65 kDa 至1 987.89 kDa，可用于草珊瑚多糖的鑒別和質(zhì)量控制。丁潔等［34］研究了來自不同產(chǎn)地的12 批次金銀花，并建立金銀花多糖的GC 指紋圖譜，有12 個(gè)共有色譜峰，主成分得分和綜合得分結(jié)果表明S12（山東）產(chǎn)地金銀花品質(zhì)最好。因此，可參考其他多糖指紋圖譜的建立方法來建立丹參多糖指紋圖譜，所建指紋圖譜可為丹參多糖的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

5 總結(jié)

目前，丹參多糖的提取方法有水提醇沉法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶輔助提取法等，主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等單糖組成，糖苷鍵連接方式以（1→6）-D-Glcp 為主，具有抗氧化、抗癌、保護(hù)肝臟、保護(hù)心肌細(xì)胞等藥理作用。目前關(guān)于丹參中酚酸和丹參酮類成分的研究報(bào)道較多，但丹參多糖的研究相對(duì)較少?，F(xiàn)今對(duì)丹參多糖的研究仍然存在一些不足：首先，依目前的報(bào)道來看，僅使用單一方法提取丹參多糖，其提取率還有待提高，且目前的工藝尚不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此可考慮使用兩種及以上方法聯(lián)合提取來提高丹參多糖的提取率，同時(shí)要探索適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝；其次，丹參多糖生物活性作用機(jī)制和使用安全性尚不明確，且均處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，限制了其在醫(yī)療和保健等領(lǐng)域的應(yīng)用，因此，未來研究還需對(duì)其在人體中的吸收、降解機(jī)制、安全性和毒理學(xué)評(píng)價(jià)做進(jìn)一步研究；最后，建立系統(tǒng)的丹參多糖指紋圖譜能較為全面地反映丹參及其制劑中所含糖類成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)丹參的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)價(jià)。因此，有必要建立丹參多糖指紋圖譜來完善丹參多糖質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并解決丹參多糖產(chǎn)品批次間質(zhì)量差異等問題，為丹參多糖及其制劑的開發(fā)和利用提供參考數(shù)據(jù)。