全基因組關(guān)聯(lián)分析顯示基因ANXA8和C10orf11為影響肌少癥的候選基因

冉 姝， 何 笑， 蔣自璇， 劉寶林， 鄧紅文

（1. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 杜蘭大學(xué) 公共健康醫(yī)學(xué)院，美國）

肌少癥（sarcopenia）是以骨骼肌質(zhì)量和功能隨年齡增長而減少為特征的多基因復(fù)雜疾病，肌少癥還與一系列其他健康問題相關(guān)，如跌倒和骨折、運(yùn)動障礙、感染、代謝紊亂等，這些都是老年人殘疾和死亡的主要原因之一[1-2]。在70歲以下的白人老年人中，有13%～24%的老人患有肌少癥，而在80歲以上的老年人中，這一比例則高達(dá)50% 或更多[3]。瘦體重（lean body mass，LBM）收縮性的下降也會導(dǎo)致骨骼負(fù)荷的下降，使骨骼長期處于閑置狀態(tài)，容易誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥[4]。肌少癥是遺傳和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病。遺傳因素可分別解釋個體間肌肉強(qiáng)度、下肢功能和日常生活能力變異的36%～65%、57%和34%[5-6]；此外，骨骼肌能量代謝中主要酶的活性都具有家族遺傳[7]。LBM是肌少癥重要的性狀[8-10]。LBM由骨骼肌（60%）、臟器等結(jié)締組織[11-12]組成，遺傳率50%以上[13]，是預(yù)測肌少癥的遺傳特征。利用雙能X射線吸收儀（DXA）可以準(zhǔn)確地測量LBM。

既往研究表明，肌少癥與骨質(zhì)疏松癥、肥胖癥均具有較高的遺傳易感性，且具有遺傳相關(guān)性，可能存在多效性基因影響這兩種疾病的發(fā)病風(fēng)險。骨和肌肉在生長過程中都對旁分泌和內(nèi)分泌刺激有共同的反應(yīng)[14]。肌肉收縮的減少導(dǎo)致骨骼負(fù)荷的減少，從而導(dǎo)致骨骼完整性的喪失[15]。在胚胎發(fā)育過程中，成骨細(xì)胞和肌肉細(xì)胞共享一個共同的間充質(zhì)干細(xì)胞?；诠敲芏龋╞one mineral density，BMD)與LBM相互作用的生物學(xué)信息，預(yù)測兩者可能存在共同的遺傳背景，即多效性的基因[16]。此外，肌少癥常與體脂增加一起出現(xiàn)，這種情況被稱為“骨骼肌減少性肥胖”[17]，它是伴隨肌量減少和肥胖增加而出現(xiàn)的一種重要的老年性疾病[18]。肌少癥和肥胖癥均具有較高的遺傳易感性，可能存在多效位點(diǎn)影響這兩種疾病的發(fā)病風(fēng)險。

候選基因連鎖分析和關(guān)聯(lián)法是早期鑒定肌少癥遺傳因子的兩種主要方法。但研究結(jié)果并不一致，其中種族、樣本大小不同等因素造成試驗(yàn)的可重復(fù)性低、所涉及的染色體區(qū)域范圍較寬可能是其重要原因。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）通過包括單核苷酸多態(tài)性變異（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）在內(nèi)的全基因組高密度遺傳標(biāo)記并分型，已成為鑒定復(fù)雜疾病致病基因的熱點(diǎn)研究方法之一[19]。最近的GWAS研究發(fā)現(xiàn)許多SNPs與LBM相關(guān)。2009年，有研究對1 000個無親緣關(guān)系美國白人進(jìn)行LBM的GWAS分析，發(fā)現(xiàn)亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）多個SNP與肌肉量顯著關(guān)聯(lián)[20]。Livshits等[21]在3 180個英國婦女研究中發(fā)現(xiàn)，肌量與MTHFR基因所在的染色體1p36位點(diǎn)存在連鎖（LOD (log odds score)值為 2.17,p值為 0.001 6）。Sun等[22]在中國人群雙變量GWAS發(fā)現(xiàn)HK2等基因的變異可以同時引起股骨頸骨幾何學(xué)參數(shù)和四肢LBM的變化。Urano等[23]對1 081個日本絕經(jīng)婦女的研究發(fā)現(xiàn)rs12409277位點(diǎn)與LBM顯著關(guān)聯(lián)，該位點(diǎn)影響轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PRDMl6的轉(zhuǎn)錄活性。Livshits等[24]對1 550例英國孿生子全基因DNA甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，一些基因DNA甲基化與肌肉量變異相關(guān)。Medina-Gomez等[25]對10 414名兒童通過雙變量GWAS薈萃分析發(fā)現(xiàn)，8個基因位點(diǎn)與LBM和頭骨密度關(guān)聯(lián)。

為鑒定與肌少癥相關(guān)聯(lián)的基因，本研究對1 000個不相關(guān)的白人樣本進(jìn)行GWAS分析。驗(yàn)證樣本包括中國漢族樣本和白人樣本。

1 研究方法

1.1 樣 本

a. 全基因研究樣本。

本研究通過了密蘇里堪薩斯大學(xué)（University of Missouri Kansas-City）倫理委員會的審查，并在開展研究前和所有參與者簽署了知情同意書。所有研究對象完成了包括各項(xiàng)生理指標(biāo)、生活習(xí)性、疾病史、家族史、運(yùn)動史等相關(guān)內(nèi)容的調(diào)查問卷。本次全基因組關(guān)聯(lián)分析從本實(shí)驗(yàn)室建立和正在擴(kuò)大的遺傳資源數(shù)據(jù)庫中的6 000多個樣本中隨機(jī)抽取了1 000個獨(dú)立樣本。所選擇樣本均來自具有歐洲血統(tǒng)的美國白種人。

b. 驗(yàn)證樣本包含中國漢族樣本和美國白人樣本。

中國漢族樣本是在湖南省長沙市征集的1 625個隨機(jī)樣本，包括823個女性樣本和802個男性樣本。本研究得到西安交通大學(xué)與湖南師范大學(xué)審查委員會批準(zhǔn)。樣本的篩選采取了和堪薩斯獨(dú)立樣本征集相同的標(biāo)準(zhǔn)。美國白人樣本包含2 283個高加索裔無血緣關(guān)系的成年人，包括556個男性和1 727個女性。所有樣本來源于美國中部密蘇里州堪薩斯城和內(nèi)布拉斯加州奧馬哈城城區(qū)及其周邊地區(qū)。本研究得到了密蘇里大學(xué)堪薩斯分校倫理委員會（Institutional Review Board, IRB）的批準(zhǔn)。驗(yàn)證樣本與第一階段的研究樣本沒有重復(fù)。

1.2 表型測量

采用Hologic公司的雙能X射線（DXA）骨密度儀（Hologic Inc., Bedford, MA, USA）掃描儀對研究對象進(jìn)行表型測量。讓受測者臥位于測量床上，從頭到腳進(jìn)行掃描。DXA能夠精確測量四肢、全身瘦體重量，以及全身脂肪量。同時測量受試者的身高（m）和體重（kg）。

1.3 基因分型和質(zhì)量控制

使用商業(yè)分離試劑盒（Gentra systems, Minneapolis,MN, USA，按說明書步驟操作）從人體血液中提取基因組DNA?；蚍中筒捎肁ffymetrix 250KNsp和Affymetrix 250K，由美國范德比爾大學(xué)醫(yī)學(xué)中心范德比爾共享中心完成，過程按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。

在個體和SNP水平上，嚴(yán)格執(zhí)行基因型質(zhì)量控制（QC）步驟。在個體水平上，使用PLINK根據(jù)X染色體上的基因型數(shù)據(jù)推斷出個體的性別，并與問卷中記錄的性別作比較，將不明確的以及與報告性別不一致的個體刪除。在SNP水平上，在最初的500 568個SNP中，舍棄了32 961個成功率小于95%的SNP、36 965個等位基因頻率顯著偏離 Hard-Weinberg（HWE）平衡的 SNPs（p＜0.001）、51 323個等位基因頻率小于1%的SNPs，同時把具有孟德爾錯誤的SNPs設(shè)為缺失值。因此，最后共有379 319個SNPs用于關(guān)聯(lián)分析。

用于驗(yàn)證的兩個樣本分別采用Affymetrix Gene Chip Human Mapping SNP 6.0芯片進(jìn)行基因分型。

1.4 統(tǒng)計分析

采用逐步回歸法（stepwise regression）檢驗(yàn)?zāi)挲g、年齡的平方、身高、體重是否對全身LBM具有顯著影響，然后采用Minitab（Minitab Inc., State College, PA, USA）來校正身高、體重等因素對LBM的影響。GWAS分析中，為了最大限度地減少因群體分層而導(dǎo)致的假陽性或假陰性結(jié)果，采用主成分分析（principal component analysis, PCA）法來校正1 000個白人樣本中潛在的種群分層。首先，在樣本中挑選一組無關(guān)樣本并計算它們的主成分，作為他們的遺傳背景信息。然后，選用前5個主成分，利用這5個主成分值對表型進(jìn)行校正，再利用校正后的表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

關(guān)聯(lián)分析使用Plink軟件（http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/summary.shtml）的加性遺傳模型分析。

為分析GWAS和驗(yàn)證研究的整體關(guān)聯(lián)證據(jù)，采用Fisher’s方法[26]的薈萃分析將研究樣本和驗(yàn)證樣本的p值整合，得到合并p值。

2 結(jié) 果

研究樣本和驗(yàn)證樣本的基本信息列于表1。

在發(fā)現(xiàn)樣本中，共有379 319個SNPs用于關(guān)聯(lián)分析。Bonferroni校正全基因組顯著性水平（GWAS，0.05/379 319=1.31×10-7），在 GWAS 水平上，沒有SNP低于這個顯著性閾值標(biāo)準(zhǔn)，p值最低的是 rs7086719（p=1.23×10-6）。在研究樣本中發(fā)現(xiàn)了809 個與LBM 相關(guān)的SNPs（p＜1×10-3，call rate＞90%，最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.01）。在1 625個不相關(guān)的中國漢族樣本中驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)40個SNPs與LBM高度關(guān)聯(lián)。將這40個SNPs在2 283個不相關(guān)的白人中進(jìn)行驗(yàn)證，最終有4個 SNPs得到驗(yàn)證（rs7905603：p=9.67×10-4；rs9416083：p=3.17×10-4；rs4409772：p=4.39×10-4；rs2894310：p=4.37×10-4），如表 2 所示。

通過其網(wǎng)頁門戶搜索國際小鼠表現(xiàn)型數(shù)據(jù)庫[27]（international mouse phenotyping consortium，IMPC）（http://www.mousephenotype.org/），發(fā)現(xiàn)敲除基因ANXA8純合子的老鼠比對照組老鼠BMD增加，同時身體脂肪量也出現(xiàn)異常（p＜0.05）。

表 2 在GWAS研究中顯示和瘦體重相關(guān)聯(lián)的SNPsTab.2 SNPs associated with LBM in GWAS

使用STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（https://stringdb.org/）對基因ANXA8進(jìn)行注釋，所得到的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示基因ANXA8與MYOD，MYOG，MYF6等調(diào)控肌肉表達(dá)的基因存在某些聯(lián)系（見圖1），ANXA8是膜聯(lián)蛋白家族中調(diào)控Ca2+結(jié)合蛋白的一個成員，它與急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）有關(guān)[28]。

圖1 ANXA8基因與肌肉代謝蛋白的STRING蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 STRING protein interaction network between ANXA8 and muscle metabolic proteins

3 討 論

ANXA8（annexin A8）是在破骨細(xì)胞分化后期強(qiáng)烈誘導(dǎo)的基因和調(diào)節(jié)細(xì)胞特有肌動蛋白環(huán)形成的蛋白。膜聯(lián)蛋白家族是多基因蛋白質(zhì)家族，最初被稱為內(nèi)酯環(huán)[29]。迄今為止，已經(jīng)有幾個膜聯(lián)蛋白家族的成員被發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與骨骼肌有關(guān)系。例如在骨骼肌中有膜聯(lián)蛋白annexin A8和annexin A5的表達(dá)[30]。annexin A1通過促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的遷移來促進(jìn)骨骼肌的分化，從而調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的分化有助于骨骼肌組織的再生[31]；另一個膜聯(lián)蛋白家族的成員annexin A6，它是一種主要的骨骼肌蛋白，在骨骼肌中高度表達(dá)[32-34]。ANXA8基因在各種白血病和淋巴細(xì)胞中活化[35-36]，ANXA8在這些細(xì)胞的增殖和/或分化中發(fā)揮著獨(dú)特的作用[37]。此外，STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)還發(fā)現(xiàn)基因ANXA8與骨骼肌肌肉相關(guān)代謝蛋白TCF3有著直接的聯(lián)系。TCF3蛋白靶基因的表達(dá)限于特定的細(xì)胞譜系，通過含有TCF3和組織限制性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）因子的異二聚體來激活細(xì)胞特異性基因表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞分化[37]。

rs9416083, rs2894310和rs4409772均位于基因C10orf11（leucine rich melanocyte differentiation associated），該基因編碼是一種富含亮氨酸的重復(fù)蛋白[38]。圖2中的haploview圖顯示C10orf11基因在白人和中國人中的LD結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Haploview 4.2軟件和從1 000個基因組計劃中獲取的鏈接數(shù)據(jù)，對 C10orf11基因的 3個 SNPs（rs9416083，rs2894310和rs4409772）分別在中國人群和歐洲白人中進(jìn)行連鎖不平衡分析。圖2（a）為中國人的分析結(jié)果，圖2（b）為歐洲白人的分析結(jié)果。圖中顏色的深淺代表對應(yīng)的兩個SNP間的LD強(qiáng)度（r2）。紅色區(qū)域表示r2=1。該區(qū)域僅包括一個LD塊，由帶有黑色線條的三角形表示。所有圖均使用Haploview軟件，根據(jù)HapMap國際計劃Phase 1和Phase數(shù)據(jù)生成。目前，對基因C10orf11的生物學(xué)功能仍知之甚少，Wada等[39]的研究表明，人類C10orf11的同源基因參與了早期腸胚中的β-連環(huán)蛋白（MIM 116806）的信號傳導(dǎo)，并表明了C10orf11的功能在β-連環(huán)蛋白的上游或平行于β-連環(huán)蛋白。

圖2 基因C10orf11中國人和歐洲白人中的LD結(jié)構(gòu)圖Fig.2 LD structure of the C10orf11 gene in the Chinese and Caucasusian sample

采用GWAS分析方法，在1 000名不相關(guān)的美國高加索人中發(fā)現(xiàn)，位于基因ANXA8和C10orf11的4個SNPs與LBM有關(guān)，它們可能會影響或者導(dǎo)致肌少癥。