樺褐孔菌醇提物抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的作用及分子機制研究

王蔚 周忠光 楊婧 劉旭 田明 喬羽 仲麗麗

[摘要] 目的 研究樺褐孔菌醇提物（IO醇提物）對胃癌BGC-823裸鼠移植瘤的抑制作用，推測其作用機制與PI3K/AKT通路相關性。 方法 48只裸鼠使用異位移植瘤造模法建立胃癌模型，造模后按照隨機數(shù)字法分為IO醇提物高劑量組（3 mg/g）、中劑量組（1 mg/g）、低劑量組（0.75 mg/g），陰性對照組（羧甲基纖維素鈉灌胃），模型組（不灌藥物），陽性對照組（卡培他濱灌胃，0.5 mg/g），每組各8只。灌胃14 d，處死小鼠，剝離腫瘤組織，稱重計算抑瘤率;光鏡和電鏡下觀察藥物干預后腫瘤組織形態(tài)變化;免疫組織化學法檢測相關蛋白4E-BP1、p27kip1、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達;逆轉錄-聚合酶鏈式反應法（RT-PCR）檢測磷酸酶基因（PTEN）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）、蛋白激酶（AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表達;蛋白免疫印跡法（Western blot）測定PI3K、p-AKT蛋白表達。 結果 與陰性對照組、模型組比較，各IO醇提物組腫瘤重量降低（P < 0.05），生長受到抑制（P < 0.05）;各IO醇提物組的腫瘤壞死、凋亡、細胞器破壞明顯;與陰性對照組、模型組比較，各IO醇提物組Bcl-2細胞平均光密度值降低，4E-BP1、p27kip1、Bax、caspase-3細胞平均光密度值升高（P < 0.05）;RT-PCR檢測結果示，PTEN在各IO醇提物組表達均高于陰性對照組、模型組，低于陽性對照組（P < 0.05），mTOR、PI3K和AKT表達低于陰性對照組、模型組，高于陽性對照組（P < 0.05）。Western blot檢測結果示，各IO醇提物組PI3K、p-AKT蛋白表達低于陰性對照組、模型組，高于陽性對照組（P < 0.05）。 結論 IO醇提物具有較為明顯的胃癌抑制作用，其機制可能與PI3K/AKT通路及其上下游因子有關。

[關鍵詞] PI3K/AKT通路;胃癌;樺褐孔菌;分子機制

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（b）-0008-06

Study on the inhibitory effect of Alcohol extract of Inonotus Obliquus on the development and progression of gastric cancer and its molecular mechanism

WANG Wei1? ?ZHOU Zhongguang2▲? ?YANG Jing1? ?LIU Xu3? ?TIAN Ming3? ?QIAO Yu4? ?ZHONG Lili5

1.Teaching and Research Department of Pathology， Basic Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 2.Teaching and Research Department of Histoembryology， Basic Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 3.Experiment and Training Center， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 4.Teaching and Research Department of Shanghan， Basic Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 5.Department of Pathology， the First Clinical Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of Alcohol extract of Inonotus Obliquus （Alcohol extract of IO） on transplanted tumor of gastric cancer BGC-823 in nude mice， and speculate the relationship between the mechanism and PI3K/AKT pathway. Methods Forty-eight nude mice were used to establish gastric cancer models by heterotopic transplantation. After modeling， they were randomly divided into Alcohol extract of IO high-dose group （3 mg/g）， middle-dose group （1 mg/g） and low-dose group （0.75 mg/g）， negative control group （hydroxymethyl cellulose sodium lavage）， model group （no drug）， positive control group （Capecitabine lavage， 0.5 mg/g）. according to the random number table method， with 8 mice in each group. Mice were sacrificed after 14 days of intragastric administration， tumor tissues were stripped and tumor inhibition rate was calculated by weighing. The morphological changes of tumor tissues after drug intervention were observed under light microscope and electron microscope. The expressions of 4E-BP1， p27kip1， Bcl-2， Bax and caspase-3 were detected by immunohistochemistry. The expressions of Phosphatase gene （PTEN）， phosphatidylinositol-3-hydroxykinase （PI3K）， protein kinase （AKT）， and target of rapamycin （mTOR） were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. The protein expressions of PI3K and p-AKT were detected by Western blot. Results Compared with the negative control group and model group， the weight of tumor were reduced in Alcohol extract of IO group （P < 0.05）， the growth in each Alcohol extract of IO groups was inhibited （P < 0.05）. In the each Alcohol extract of IO groups， tumor necrosis， apoptosis and organelle destruction were more obvious （P < 0.05）. Compared with the negative control group and model group， the average optical density of Bcl-2 in each Alcohol extract of IO groups was decreased， the average optical density of 4E-Bp1， p27kip1， Bax and caspase-3 was increased （P < 0.05）. RT-PCR detect results showed that， the expression of PTEN in each Alcohol extract of IO groups was higher than that in the negative control group and model group， and was lower than that in the positive control group （P < 0.05）; the expressions of mTOR， PI3K and AKT in the each Alcohol extract of IO groups were higher than those in the positive control group， and were lower than those in the negative control group and model group （P < 0.05）. Western blot detect results showed that， the expressions of PI3K and p-AKT protein in each Alcohol extract of IO groups were lower than those in negative control group and model group， and were higher those that in the positive control group （P < 0.05）. Conclusion Alcohol extract of IO has obvious inhibitory effect on gastric cancer， and its mechanism may be related to PI3K/AKT pathway and its upstream and downstream factors.

[Key words] PI3K/AKT pathway; Gastric cancer; Inonotus Obliquus; Molecular mechanism

胃癌是癌癥死亡的第二大原因，它發(fā)病隱匿，致癌因素常見，我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)的胃癌約占全球新發(fā)胃癌的50%[1]。胃癌術后5年生存率低于25%，這嚴重影響社會勞動力和生產活動，給患者的家庭帶來了危害[2]。胃癌的常規(guī)治療方法是手術加化療，近年來對于胃癌根治術有所改進[3]，但發(fā)展更大的是藥物治療方面，特別是中草藥的使用，改善了患者術后的生存情況，減弱了化療藥物的毒副作用，提高患者生存年限和生命質量。中草藥可以從整體改善機體狀態(tài)，提高免疫力，某些中草藥的提取物對腫瘤本身也具有攻擊能力[4]。樺褐孔菌醇提物就是這樣一類在樺褐孔菌（Inonotus Obliquus，IO）中提取的混合物，主要包括樺褐孔菌醇等[5]。課題組的前期工作證明了其對多種消化系統(tǒng)腫瘤的抑制作用，現(xiàn)進一步探究其對胃癌抑制作用的機制。胃癌的發(fā)生與很多信號通路有關，其中PI3K/AKT信號通路的地位不可替代，它與細胞的增殖、凋亡、轉移等都密切相關[6]。本研究推測樺褐孔菌醇提物抗胃癌作用也與此通路相關，磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）、蛋白激酶（AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及其下游的分子均有可能成為其效應分子。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

裸鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006，雄性，體重17～22 g。在無特定病原體條件下（SPF級）飼養(yǎng)。實驗動物來自具有實驗動物生產許可證的機構，撰寫的文章中動物實驗內容與實際使用情況相符，符合倫理委員會要求，并在其監(jiān)督下進行。

1.2 主要儀器與試劑

人系BGC-823胃癌細胞（中國科學院上海細胞生物研究所）;樺褐孔菌醇提物（由黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院提供，純度>90%）;胎牛血清、RPMI-1640、胰酶、山羊血清、抗體（6 mL，北京中杉金橋生物公司）;Western blot試劑（碧云天生物技術有限公司，P0013）;RT-PCR試劑盒[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，DRR037]。CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）;酶標分析儀（南京德鐵實驗設備有限公司）;紫外分光光度計（日本島津，UV-2401）;熒光定量（美國ABI，PCR7500）;PageRulerTM Prestained Protein Ladder（美國Thermo公司，26616）。

1.3 實驗分組與處理

選取雄性裸鼠，4～6周齡，體重20 g左右，在SPF級動物房內72 h適應性飼養(yǎng)。采用異位移植瘤造模法造模，取對數(shù)生長期的胃癌BGC-823細胞培養(yǎng)至需要數(shù)量，消化后調整細胞密度為2×106個/mL，接種于小鼠腋下，接種量為0.2 mL細胞懸液。7 d后小鼠腋下出現(xiàn)直徑>1 cm的皮下結節(jié)為建模成功，按隨機數(shù)字表法分為6組，每組8只裸鼠。各IO醇提物組采用羧甲基纖維素鈉（CMC）作為溶劑，IO醇提物高劑量組（3 mg/g），IO醇提物中劑量組（1 mg/g），IO醇提物低劑量組（0.75 mg/g）;陽性對照組使用卡培他濱，按體表面積折算后，劑量為0.5 mg/g;陰性對照組給予CMC溶劑。各藥物組和對照組每只小鼠0.3 mL灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃14 d。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 IO醇提物對BGC-238荷瘤小鼠抑瘤率測定? 停藥次日處死動物，取腫瘤稱重，計算腫瘤重量抑制率[腫瘤重量抑制率=（W對照組-W實驗組）/W對照組×100%]。

1.4.2 光鏡及電鏡下觀察腫瘤形態(tài)? 蘇木精-伊紅（HE）染色：切取組織塊厚度為0.2～0.3 cm，用4%甲醛固定，脫水、透明，切片，烤片，HE染色。電鏡觀察切取組織塊大小為0.2 cm×0.5 cm×1.0 cm，預固定使用2%～3%戊二醛固定液，蒸餾水沖洗后1%鋨酸固定，0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液浸洗，乙醇梯度脫水，浸透，環(huán)氧樹脂包埋，醋酸鈾染色，觀察細胞及細胞器的形態(tài)變化。

1.4.3 免疫組化法檢測相關蛋白表達? 石蠟切片脫水后，去除內源性過氧化氫酶，抗原修復后加入一抗，室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗后加二抗，室溫孵育5～10 min，去除PBS液，加DAB液顯色，蘇木精復染，自來水返藍。酶標儀檢測4E-BP1、p27kip1、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白平均光密度值。

1.4.4 RT-PCR檢測相關mRNA表達? 據(jù)NCBI GeneBank上的基因序列設計一對引物，擴增的片段長度為100～300 bp。采集組織樣用于提取總RNA，于酶標儀280 nm處進行檢測吸光度。兩步法PCR擴增標準程序：預變性95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。凝膠電泳，凝膠成像顯影。測定PTEN、PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達量。

1.4.5 Western blot檢測PI3K、p-AKT蛋白表達? 不同組織經(jīng)裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）電泳分離蛋白，PVDF膜轉膜，TBST緩沖液洗滌2次，5%脫脂牛奶封閉，一抗（1∶1000）4℃冰箱過夜，二抗（1∶1000）室溫下孵育1 h免疫雜交。濾干，將顯影底物A和B等體積混合至滴注于PVDF膜上，約1 min后凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，連續(xù)性變量采用Kolmogorov-Smirnov進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，不同組間小鼠瘤重的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IO醇提物對荷瘤小鼠腫瘤重量的影響

給藥后，與陰性對照組及模型組比較，各IO醇提物組的腫瘤重量均減輕（P < 0.05），但較陽性對照組的瘤重增高，抑瘤率降低（P < 0.05），高劑量組抑瘤作用明顯。見表2。

2.2 移植瘤形態(tài)變化情況

2.2.1 組織結構改變? 藥物干預后胃癌BGC-823荷瘤小鼠的腫瘤變化明顯。HE切片IO醇提物高、中、低劑量組均見腫瘤細胞凝固性壞死，細胞質深染，其中IO醇提物高劑量組壞死細胞較多，與陽性對照組相似，較陰性對照組和模型組血管及腫瘤細胞數(shù)量減少。見圖1。

2.2.2 超微結構改變? 各IO醇提物組可見較多壞死、凋亡、焦亡細胞，細胞碎片多，細胞器腫脹，線粒體嵴減少，腫瘤細胞核裂解成塊或固縮;IO醇提物低劑量組細胞殘存較多，IO醇提物高劑量組空白區(qū)域多見。陽性對照組凋亡、焦亡細胞，細胞器改變明顯，細胞質見空泡。陰性對照組和模型組均可見腫瘤細胞發(fā)育良好，細胞器功能及結構完善，腫瘤細胞核大，完整且深染，核內的染色體及核仁明顯。見圖2。

2.3 IO醇提物對胃癌BGC-823荷瘤小鼠的4E-BP1、p27kip1、Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白吸光度的影響

免疫組化染色顯示，4E-BP1、p27kip1、Bcl-2、Bax、caspase-3在細胞質有表達，呈黃染顆粒，見圖3。4E-BP1、p27kip1、Bax、caspase-3在各IO醇提物組的平均光密度值隨藥物濃度降低呈遞減趨勢，均低于陽性對照組（P < 0.05），高于陰性對照組和模型組（P < 0.05）;各IO醇提物組Bcl-2平均光密度值隨藥物濃度降低呈遞增趨勢，均高于陽性對照組（P < 0.05），低于陰性對照組和模型組（P < 0.05）。見表3。

2.4 IO醇提物對胃癌BGC-823荷瘤小鼠的mTOR、PTEN、PI3K、AKT的mRNA影響

PTEN mRNA在各IO醇提物組表達均高于陰性對照組和模型組，低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;隨著IO醇提物濃度的提高，PTEN mRNA的表達呈上升趨勢。各IO醇提物組mTOR、PI3K、AKT的mRNA表達均低于陰性對照組和模型組，高于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表4。

2.5 IO醇提物對胃癌BGC-823荷瘤小鼠PI3K、p-AKT蛋白的影響

與陰性對照組和模型組比較，各IO醇提物組PI3K和p-AKT表達較低（P < 0.05），但高于陽性對照組（P < 0.05）。見圖4、表5。

3 討論

俄羅斯人用樺褐孔菌泡酒來治療腫瘤，它有“西伯利亞靈芝”之稱[7-9]。樺褐孔菌醇提物具有良好的抑制腫瘤細胞增殖，加速腫瘤細胞凋亡等作用[10-11]。李根培等[12]用樺褐孔菌醇提物作用小鼠S180肉瘤，發(fā)現(xiàn)對其生長有顯著抑制作用。白楊等[13]證明樺褐孔菌醇對人卵巢癌SKOV3細胞的增殖和凋亡具有影響。王李俊等[14]證明樺褐孔菌醇可誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡。Zhang等[15]指出樺褐孔菌醇可以抑制Hela細胞的遷移、侵襲。

在胃癌生長與抑制的各種機制中，PI3K/AKT/mTOR信號通路至關重要，大量的臨床研究顯示，在胃癌及癌旁組織中均有PI3K、p-AKT蛋白的陽性表達，且表達水平與腫瘤大小、有無淋巴結轉移、浸潤程度、分化程度及分型有關[16-17]。馬志恒等[18]在胃癌組織、癌旁組織、正常黏膜組織檢測p-AKT蛋白，陽性率分別為68%、49%、21%。程玉等[19]收集25例正常胃組織和60例胃癌組織，發(fā)現(xiàn)PI3K mRNA、AKT1 mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達高于正常胃組織，胃癌浸潤加深，淋巴結轉移p-AKT、PI3K表達量升高。Singh等[20]分析PTEN、PI3K、mTOR對胃癌細胞的作用機制，發(fā)現(xiàn)此通路的抑制劑可以改善胃癌的惡化狀態(tài)。這一通路所調控下游分子對腫瘤的生長產生影響，4E-BP1與eIF-4G有競爭性抑制作用，從而影響蛋白質合成;mTOR可以使p70S6K磷酸化激活，啟動蛋白質翻譯信號，增強某些mRNA的轉錄和翻譯。AKT下游分支可以影響B(tài)cl-2/bax、caspase-3的蛋白表達[21-24]。

本研究的結果顯示，IO醇提物灌胃后，促進腫瘤增長的活性因子PI3K、AKT、mTOR表達下降，抑制腫瘤生長PTEN表達增加。PTEN抑癌基因表達增加，重要調控底物PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達減少;PI3K/AKT通路關鍵蛋白PI3K、p-AKT的表達降低。其抗胃癌作用機制即可能為上調PTEN，抑制PI3K、p-AKT、mTOR的表達，影響整個通路;同時或可直接影響某些底物，如4E-BP1、p70S6K、Bcl-2、bax、caspase-3等的蛋白表達，抑制腫瘤生長，促進腫瘤凋亡。

綜上所述，推測樺褐孔菌醇提物可通過PI3K/AKT通路抑制胃癌BGC-823細胞增殖，促進細胞凋亡。結果提示樺褐孔菌醇提物可能成為一種新的有效的胃癌抑制藥物，從而脫離樺褐孔菌作為保健品使用的命運，但目前對于樺褐孔菌抗腫瘤作用的機制還需更進一步研究，以保證其臨床使用的可靠性、安全性。

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（收稿日期：2019-07-18? 本文編輯：任? ?念）