蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑制效果初探

魯韻　王一凡　李二峰

摘要：為探究蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌尖孢鐮刀菌的抑制效果，本試驗(yàn)設(shè)置不同濃度蔥粗提取液，研究其對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)速率、孢子產(chǎn)量、孢子萌發(fā)率、菌絲結(jié)構(gòu)的影響，并進(jìn)行甘藍(lán)枯萎病盆栽防效試驗(yàn)。結(jié)果表明：蔥粗提取液對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。當(dāng)PDA培養(yǎng)基中蔥粗提取液濃度為0.6 g/mL時(shí)，抑菌率可達(dá)56.3%;培養(yǎng)基中蔥提取液濃度為0.4 g/mL時(shí)，尖孢鐮刀菌孢子產(chǎn)量抑制率和孢子萌發(fā)抑制率分別達(dá)到97.7%、92.1%;顯微鏡觀察顯示，蔥粗提取液濃度越大，對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)影響越大。盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)土壤中蔥粗提取液濃度為0.043 g/g土?xí)r，接種7 d后的防治效果可達(dá)到65.9%。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)枯萎病; 尖孢鐮刀菌; 蔥粗提取液; 抑菌效果

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.35文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）04-0136-05

Abstract In order to investigate the inhibitory effect of crude extracts from shallot on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans （Foc）， different concentrations of shallot crude extracts were set to explore their influences on growth rate， spore yield， spore germination rate and hyphae structure of Foc， and the pot experiment was also conducted to determine their control efficiency. The results showed that the crude extracts of shallot had significant inhibitory effect on the growth of Foc. When the concentration of shallot crude extracts was 0.6 g/mL in PDA medium， the inhibitory rate was 56.3%. When the concentration of shallot crude extract was 0.4 g/mL， the inhibitory rate on spore yield and germination was 97.7% and 92.1%， respectively. Meanwhile， the morphological structure of mycelia was also changed as the concentration of shallot crude extracts increased. In the pot experiment， when the concentration of shallot crude extracts was 0.043 g per gram soil， the control effeciency reached 65.9% after inoculation for seven days.

Keywords Cabbage fusarium wilt; Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans; Crude extract of shallot; Inhibitory effect

甘藍(lán)是一種十字花科蕓苔屬蔬菜，是我國(guó)重要的蔬菜之一[1]。甘藍(lán)枯萎病是由粘團(tuán)專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans， Foc）引起的土傳病害，一般通過(guò)雨水、土壤、灌溉和農(nóng)具等途徑傳播[2-5]。該病害被譽(yù)為“植物界的癌癥”，防治較為困難，一旦發(fā)生，將會(huì)嚴(yán)重影響甘藍(lán)產(chǎn)量，給農(nóng)戶(hù)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。

目前，植物病害防治研究的熱點(diǎn)之一為開(kāi)發(fā)植物源殺菌劑。該類(lèi)殺菌劑是利用具有殺菌、抑菌活性的某些植物部位，從中提取有效成分或分離純化單體物質(zhì)加工而成的防治藥劑[6]。開(kāi)發(fā)利用該類(lèi)殺菌劑不僅對(duì)環(huán)境友好、人畜無(wú)毒，同時(shí)也為解決病原菌抗藥性提供了很大可能[7]。已有很多報(bào)道證實(shí)植物提取液以及分泌物能有效地抵御病原菌侵染[8]，如蔥汁液以及葡萄葉提取物可抑制茄子黃萎病菌（Verticillium dahliae）[9];蕁麻、曼陀羅、馬桑及商陸提取液可抑制核桃黑斑病伴生病原菌成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）[10];銀杏、馬尾松提取物可以抑制青枯病菌（Ralstonia solanacearum）[11];洋蔥鱗莖粗提物可以抑制蘋(píng)果輪紋病菌（Physalospora piricola Nose）[12]。在枯萎病防治領(lǐng)域，該類(lèi)相關(guān)研究也陸續(xù)開(kāi)展，如：高濃度的蒜根系分泌物對(duì)石榴枯萎病菌（Ceratocystis fimbriata）的菌絲生長(zhǎng)有明顯抑制作用[13];蒜和蔥提取物對(duì)香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）的菌落生長(zhǎng)有明顯抑制作用[14];韭菜粗提取物對(duì)香蕉枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，可使病原菌菌絲結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時(shí)對(duì)孢子有致死作用[7];西芹鮮根浸提液對(duì)黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cucumeris）的孢子產(chǎn)量和孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，對(duì)其菌絲形態(tài)也有影響[15]。

目前，甘藍(lán)枯萎病的主要防治方法有抗病育種法、輪作換茬法以及化學(xué)藥劑防治法等[16]，有關(guān)植物粗提取液對(duì)該病害抑制效果的報(bào)道較少[17]。自2001年北京市延慶地區(qū)報(bào)道甘藍(lán)枯萎病發(fā)生后，該病害在我國(guó)有逐年加重的趨勢(shì)[18，19]，因此，尋找該病害的新防治方法迫在眉睫。本試驗(yàn)研究了不同濃度大蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑制效果，以期為開(kāi)發(fā)新的植物源農(nóng)藥提供參考，并為甘藍(lán)枯萎病的綠色防控提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌（F.oxysporum f.sp. conglutinans），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所真菌病害課題組提供。

抑菌試驗(yàn)所用蔥粗提取液：取鮮蔥200 g，洗凈晾干后切成5 cm小段，加100 mL蒸餾水，用榨汁機(jī)打碎，裝入離心管;13 000 r/min離心10 min，離心4次，直至上清液透明;用0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾上清液，將濾液調(diào)整為2 g/mL的水提原液，4℃保存?zhèn)溆肹5]。

盆栽防效試驗(yàn)所用蔥粗提取液：取鮮蔥200 g，洗凈晾干后切成5 cm小段，加1 000 mL蒸餾水，用榨汁機(jī)打碎，調(diào)整為0.2 g/mL濃度的水提原液，備用。

1.2 蔥粗提取液對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)速率的影響

參照文獻(xiàn)[5，7]的方法，分別取0、2、4、6 mL的蔥粗提取液至培養(yǎng)皿中（Φ=9 cm），將冷卻至37℃左右的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）倒入上述培養(yǎng)皿中，每皿20 mL，混勻，配制成含有粗提取液濃度分別為0、0.2、0.4、0.6 g/mL的培養(yǎng)基;取培養(yǎng)5 d的甘藍(lán)枯萎病菌平板，用直徑0.8 cm打孔器打成大小一致的菌餅，接種于上述培養(yǎng)基中，分別記為CK、T1、T2、T3處理，每處理重復(fù)3皿。將培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，觀察菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)狀況，比較其生長(zhǎng)速率。

凈生長(zhǎng)量（cm）=菌落直徑-菌餅直徑;

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)量-處理菌落凈生長(zhǎng)量）/對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)量×100。

1.3 蔥粗提取液對(duì)尖孢鐮刀菌分生孢子產(chǎn)量的影響

將尖孢鐮刀菌接種在馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基中，置于180 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)3 d，離心收集孢子，再用無(wú)菌去離子水沖洗3次，將孢子懸浮液稀釋為每毫升?1×106個(gè)，備用。取0、10、20、30 mL蔥粗提取液，分別加入70 mL PDB培養(yǎng)基，用無(wú)菌水補(bǔ)充體積至100 mL，得到含有蔥粗提取液濃度分別為0、0.2、0.4、0.6 g/mL的培養(yǎng)基，分別加入1 mL孢子懸浮液，記為CK、T1、T2、T3處理，每處理重復(fù)3瓶。置于180 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)7 d后過(guò)濾分生孢子。顯微鏡下觀察分生孢子的生長(zhǎng)情況，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度。

1.4 蔥粗提取液對(duì)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

孢子收集方法同1.3，將收集好的孢子用PDB培養(yǎng)基稀釋至孢子濃度為每毫升1×107個(gè)，分別取200 μL加至盛有500 μL PDB培養(yǎng)基的2.0 mL離心管中，各加入0、50、100、200 μL蔥粗提取液，最后用無(wú)菌水補(bǔ)充總體積為1 mL，此時(shí)不同離心管中蔥粗提取液濃度分別為0、0.1、0.2、0.4 g/mL，記為CK、T1、T2、T3處理，每處理重復(fù)3管。將各處理置于28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，用普通光學(xué)電鏡觀察孢子萌發(fā)情況，每重復(fù)取樣觀察3次，每次觀察約100個(gè)孢子[2]。

孢子萌發(fā)率（%）= （萌發(fā)孢子總數(shù)/觀察孢子總數(shù)）×100;

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

1.5 蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病的盆栽防效試驗(yàn)

分別取?0、15、30、60 mL的蔥粗提取液與70 g土壤混勻，裝入苗缽中，此時(shí)土壤中蔥粗提取液濃度分別為?0、0.043、0.086、0.172 g/g土，記為CK、T1、T2、T3處理;將三葉一心期的甘藍(lán)幼苗在濃度為每毫升1×107個(gè)甘藍(lán)枯萎病菌孢子的懸浮液中浸泡20 min，移栽到上述苗缽中。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)15～20 株甘藍(lán)幼苗。光照培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)7 d后調(diào)查植株發(fā)病情況，并根據(jù)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算病情指數(shù)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，無(wú)癥狀;1 級(jí)，1 片葉輕微變黃;2 級(jí)，1～2 片葉葉脈輕至中度變黃：3 級(jí)，除心葉外，其余葉片中度變黃萎蔫;4 級(jí)，全部葉片重度變黃或萎蔫;5 級(jí)，葉片完全萎蔫并變黃。

病情指數(shù)?=Σ（各級(jí)發(fā)病數(shù) × 各級(jí)代表值）/（處理總數(shù) × 最高級(jí)代表值）×100;

防效（%）=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，SPSS 19.00軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔥粗提取液對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)速率的影響

由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)基中蔥粗提取液濃度的增大，尖孢鐮刀菌的菌落直徑變小。培養(yǎng)7 d時(shí)，CK的菌落直徑為8.8 cm，T1、T2、T3處理的菌落直徑分別為5.5、5.1、4.3 cm，均顯著低于CK，抑菌率分別為41.3%、46.3%和56.3%。表明蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌直徑有明顯的抑制作用，蔥粗提取液濃度越高，抑制作用越明顯。

2.2 不同濃度蔥粗提取液對(duì)尖孢鐮刀菌孢子產(chǎn)量的影響

由圖2可以看出，T1、T2、T3處理的尖孢鐮刀菌孢子濃度分別為每毫升13.83×106、0.85×106、0.22×106個(gè)，對(duì)應(yīng)孢子產(chǎn)量抑制率分別為62.0%、97.7%、99.4%，與CK相比，孢子產(chǎn)量均顯著下降。表明，蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的孢子產(chǎn)量有顯著的抑制作用，濃度越大，抑制作用越明顯。

2.3 不同濃度蔥粗提取液對(duì)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

經(jīng)觀察，T1、T2處理的孢子雖有萌發(fā)，但萌發(fā)出的菌絲長(zhǎng)度明顯短于CK，并且隨著蔥粗提取液濃度的增大，孢子萌發(fā)出的菌絲長(zhǎng)度變短;T3處理的孢子不萌發(fā)，未觀察到菌絲。培養(yǎng)24 h后，T2處理的孢子萌發(fā)率為?75.5%，顯著低于CK，T3處理的孢子萌發(fā)率僅為7.1%，抑制率高達(dá)92.1%，與CK差異顯著（圖3）。表明，蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用，濃度越大，抑制作用越明顯。

2.4 蔥粗提取液對(duì)菌絲形態(tài)的影響

通過(guò)顯微鏡觀察，不同濃度蔥粗提取液的培養(yǎng)基中，甘藍(lán)枯萎病菌的菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化。未經(jīng)蔥粗提取液處理的菌絲表面光滑，有隔膜;蔥粗提取液處理濃度為0.2、0.4 g/mL時(shí)，菌絲變細(xì)，部分變形扭曲甚至萎縮，同時(shí)可觀察到菌絲隔膜減少;當(dāng)培養(yǎng)基中蔥粗提取液濃度為0.6 g/mL時(shí)，視野下未見(jiàn)正常形態(tài)的菌絲結(jié)構(gòu)，菌絲已經(jīng)發(fā)生裂解，甚至部分孢子不萌發(fā)，直接裂解或成片狀。

2.5 蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病的盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果

由圖4可以看出，土壤中加入不同濃度蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病的發(fā)生有一定防效，當(dāng)蔥粗提取液濃度為0.043 g/g土?xí)r，防效最好。

由表1可以看出，接種7 d后，CK的甘藍(lán)幼苗病情指數(shù)達(dá)到59.7，?T1處理的甘藍(lán)幼苗病情指數(shù)顯著低于CK，為20.3，防治效果達(dá)到65.9%。T2、T3處理的甘藍(lán)幼苗病情指數(shù)和防治效果分別為51.0和55.7、14.6%和6.7%，與CK相比防效不顯著。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)得出，蔥粗提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌尖孢鐮刀菌有明顯抑制作用，表現(xiàn)在菌落生長(zhǎng)速率降低、孢子產(chǎn)量下降、孢子萌發(fā)率降低、菌絲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變甚至消解;并且蔥粗提取液濃度越大，抑制效果越強(qiáng)。但在盆栽防效試驗(yàn)中，低濃度的蔥粗提取液防效最好，高濃度的提取液可能對(duì)甘藍(lán)本身有一定刺激作用，導(dǎo)致其生長(zhǎng)勢(shì)減弱，更容易發(fā)生病害，因而防效不顯著。這與杜黎黎[20]利用不同濃度分蘗洋蔥鱗莖粗提液防治西瓜枯萎病的研究結(jié)果相似，均得出植物提取物濃度越高時(shí)，防效并未達(dá)到最好，反而某個(gè)較低濃度下的病害防治效果最好。

隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和自身健康需求的日益增長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)綠色、環(huán)保、安全、高效的植物病害防控試劑將成為未來(lái)植物保護(hù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。生物防治相對(duì)于化學(xué)防治而言更為安全環(huán)保，相對(duì)于抗病品種選育而言更為快速[7]。其中植物源殺菌劑較化學(xué)藥劑擁有更好的降解和應(yīng)用前景[10]。本試驗(yàn)結(jié)果為甘藍(lán)枯萎病防治提供了新方向，并為開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)環(huán)保的植物源農(nóng)藥提供參考。

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