基于mtCOI基因?qū)θ肭稚綎|各地草地貪夜蛾的分子鑒定

王鵬 賀培從 朱軍生 國棟 褚棟

摘要：草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是新傳入我國的重要害蟲。本研究利用mtCOI基因作為分子標(biāo)記，對傳入山東省9個(gè)地市17個(gè)縣（市、區(qū)）的49個(gè)草地貪夜蛾樣本進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明，山東地區(qū)共發(fā)現(xiàn)兩個(gè)mtCOI單倍型，系統(tǒng)發(fā)育分析表明分別隸屬于玉米型與水稻型，其中傳入濟(jì)寧梁山的為玉米型（占6.1%），其余地區(qū)均為水稻型（93.9%）。本研究明確了傳入山東省的草地貪夜蛾單倍型及其分布，對該蟲的預(yù)警與防控具有參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：草地貪夜蛾;mtCOI;水稻型;玉米型;山東省

中圖分類號(hào)：S433.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2020）02-0097-04

Abstract As an important pest introduced into China this year， Spodoptera frugiperda has been discovered in Shandong Province leading to a serious threat to the food security. In this study， the mitochondrial COI gene was used as a molecular marker to identify 49 S. frugiperda samples from 17 districts of 9 cities in Shandong Province. The results showed that two mtCOI haplotypes were identified， and the individuals from Liangshan of Jining City belonged to corn strain （6.1%） while the rest belonged to rice strain （93.9%）. In this study， the haplotypes of S. frugiperda and their distribution in Shandong Province were clarified， which had important guiding significance for the future risk assessment and management of this pest.

Keywords Spodoptera frugiperda; mtCOI; Corn strain; Rice strain; Shandong Province

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（Smith），又稱秋粘蟲，屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）。該蟲原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有雜食性、遷飛性、暴發(fā)性以及繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來逐漸成為一種世界范圍的重大入侵農(nóng)業(yè)害蟲[1]。該蟲自今年傳入我國以來，已在至少22省1 280個(gè)縣（市、區(qū)）為害，發(fā)生面積超過80萬公頃[2]。山東省于2019年6月20日在臨沂市郯城首次通過誘捕器發(fā)現(xiàn)一只雄蟲，7月16日在滕州市首先發(fā)現(xiàn)幼蟲為害。目前，山東半島、魯南和魯西南地區(qū)均發(fā)現(xiàn)該蟲為害。

草地貪夜蛾具有極廣的食物譜，能危害80多種作物，特別是能導(dǎo)致玉米、水稻、高粱、牧草等禾本科作物嚴(yán)重減產(chǎn)[3]。該蟲分為水稻型（rice strain）和玉米型（corn strain），兩者在表型上幾乎無法區(qū)分，性信息素組分也相同，甚至可以雜交產(chǎn)生可育后代[4]。但在寄主植物種類的偏好性、交配行為以及性信息素組分的比例等方面存在一定差異[5-7]。對草地貪夜蛾進(jìn)行分子鑒定、明確傳入山東的草地貪夜蛾亞型，有助于了解該害蟲傳入途徑，可為其生物學(xué)特性研究奠定基礎(chǔ)，對該害蟲的防控具有重要意義。

目前，線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因（mtCOI）[8-10]以及位于核基因組Z染色體上的磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因（Tpi）[11，12]被作為草地貪夜蛾鑒定以及區(qū)分不同亞型的主要分子標(biāo)記。通過兩種標(biāo)記基因的鑒定，發(fā)現(xiàn)入侵我國的草地貪夜蛾種群線粒體基因組絕大多數(shù)為水稻型，而基于核基因組Tpi基因分析則全部為玉米型[13，14]。目前，入侵山東地區(qū)草地貪夜蛾的亞型和種群遺傳特征尚不明確。

本研究利用mtCOI基因，對采集自山東境內(nèi)49個(gè)草地貪夜蛾樣品進(jìn)行分子鑒定，以期進(jìn)一步明確蟲源信息及其發(fā)生特征和暴發(fā)規(guī)律，并為指導(dǎo)山東草地貪夜蛾的監(jiān)測預(yù)警和早期控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山東省各地初期發(fā)現(xiàn)的草地貪夜蛾疑似樣本，共49個(gè)個(gè)體，均為4～6齡期幼蟲。采集地點(diǎn)包括青島、煙臺(tái)、威海、日照、臨沂、濟(jì)寧、菏澤、聊城、棗莊等地市下屬的17個(gè)縣（市、區(qū)）。寄主均為苗期至抽雄初期的玉米，每地點(diǎn)樣品數(shù)1～6個(gè)。樣品采集后，活體常溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步的鑒定和檢測工作。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

樣品DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒。單頭蟲體用液氮研磨后，按照說明書進(jìn)行提取，后利用純化的DNA作為模板，對mtCOI基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列參照Nagoshi等[11]的設(shè)計(jì)，上游引物：5′-TTCGAGCTGAATTAGGGACT-3′，下游引物：5′-GATGTAAAATATGCTCGTGT-3′。PCR反應(yīng)體系（13 μL）：DNA 模板1.5 μL，buffer 1.3 μL，上下游引物各0.26 μL，dNTP 0.26 μL，Taq酶0.13 μL，ddH2O 9.3 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用1%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，選取與目標(biāo)片段長度一致的單一片段PCR產(chǎn)物切膠、回收并送擎科生物股份有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載部分已發(fā)布的草地貪夜蛾（已確認(rèn)的玉米型和水稻型）對應(yīng)基因序列，以棉鈴蟲mtCOI序列作為外群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。選取Kimura-2參數(shù)模型，依據(jù)鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各分支的自舉檢驗(yàn)值（bootstrap）1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾mtCOI單倍型判斷與系統(tǒng)發(fā)育分析

將山東各地區(qū)樣本的mtCOI基因序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)山東省的mtCOI基因僅有兩個(gè)單倍型，分別命名為山東單倍型1和山東單倍型2。系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，山東單倍型1的mtCOI序列與來自中國廣東、印度、巴西、南非、美國的水稻型序列聚在一起，應(yīng)屬于水稻型;山東單倍型2的序列與美國、中國廣東、墨西哥玉米型序列聚在一起，應(yīng)屬于玉米型。

2.2 草地貪夜蛾mtCOI單倍型的分布

山東地區(qū)采集的49個(gè)個(gè)體中，山東單倍型1共46個(gè)，占93.9%，分布于青島市城陽、即墨、膠州、平度和棗莊市滕州、日照市嵐山、日照市五蓮、臨沂市臨沭、臨沂市郯城、煙臺(tái)市海陽、威海市乳山、威海市榮成、煙臺(tái)市牟平、聊城市東昌府、菏澤市東明和菏澤市鄄城共16個(gè)縣（市、區(qū)）;山東單倍型2共3個(gè)個(gè)體，占6.1%，均出自濟(jì)寧市梁山（表1，圖2）。

3 討論與結(jié)論

本研究以mtCOI作為分子標(biāo)記，對首次入侵山東各地的草地貪夜蛾樣本進(jìn)行了分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)mtCOI單倍型，分別屬于玉米型和水稻型，其中屬于水稻型的單倍型樣本占絕大多數(shù)，因此，入侵山東省的草地貪夜蛾并非單一來源。張磊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，侵入中國地區(qū)的草地貪夜蛾的線粒體基因組以水稻型為主，玉米型僅占極少數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。

草地貪夜蛾的不同亞型直接決定對寄主植物的取食偏好性。目前入侵的草地貪夜蛾以為害玉米為主，但也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其在小麥、花生、水稻和大豆等作物上的為害證據(jù)[15-17]。本研究通過分子鑒定，明確入侵山東草地貪夜蛾的線粒體單倍型構(gòu)成，為進(jìn)一步探究草地貪夜蛾寄主選擇和種群遺傳學(xué)信息的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，對今后草地貪夜蛾的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、精準(zhǔn)監(jiān)測預(yù)警和綠色防控具有重要指導(dǎo)意義。

參 考 文 獻(xiàn)：

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