殼聚糖與殼寡糖抑菌保鮮研究進(jìn)展

楊煥蝶 張翔 亞歷山大·蘇沃洛夫 陳蕾蕾 趙雙枝 王軍華 王維婷 楊金玉

摘要：果蔬采后呼吸作用旺盛，表面微生物代謝活躍，內(nèi)部水分容易蒸發(fā)，品質(zhì)極易在運(yùn)輸及儲(chǔ)藏過(guò)程中下降。殼聚糖與殼寡糖具有廣譜的抑菌效應(yīng)及良好的生物相容性，相比于傳統(tǒng)的合成保鮮劑，具有無(wú)毒、高效、低殘留的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于采后果蔬的保鮮處理。本研究著重對(duì)殼聚糖與殼寡糖的生物活性、制備方法、抑菌機(jī)制及其在果蔬保鮮應(yīng)用等方面的最新成果進(jìn)行綜述，并提出了未來(lái)兩種物質(zhì)在果蔬保鮮應(yīng)用上的主要發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：殼聚糖;殼寡糖;制備;抑菌機(jī)制;保鮮

中圖分類號(hào)：S379 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2020）02-0167-06

Abstract Quality of postharvest fruits and vegetables are easy to be seriously degraded during transportation and storage due to vigorous respiration， active metabolism of surface microorganisms and evaporation of internal moisture. Chitosan and chitooligosaccharide have broad-spectrum antimicrobial effects and good biocompatibility. Compared with traditional synthetic preservatives， chitosan and chitooligosaccharides are non-toxic， efficient and low residual. Therefore they have been widely used in fresh-keeping post-harvest fruits and vegetables. This paper focused on the latest research progresses of chitosan and chitooligosaccharide in biological activity， preparation method， antimicrobial mechanism and preservation of postharvest fruits and vegetables. The main research directions of chitosan and chitooligosaccharides for preservation of postharvest fruits and vegetables in the future were put forward.

Keywords Chitosan; Chitooligosaccharides; Preparation; Antimicrobial mechanism; Preservation

殼聚糖及其衍生物資源豐富，制備方法簡(jiǎn)單，具有多種生物活性。殼寡糖是殼聚糖經(jīng)物理化學(xué)或者生物酶法制備的降解產(chǎn)物。殼聚糖和殼寡糖均具有低殘留、無(wú)毒等特性，利用它們的抑菌活性及成膜性對(duì)果蔬進(jìn)行保鮮處理，能夠有效延長(zhǎng)果蔬貨架期，是近年來(lái)新興的一種綠色保鮮技術(shù)。本研究對(duì)殼聚糖和殼寡糖的生物活性、制備方法、抑菌機(jī)制及其在果蔬保鮮應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，旨在為了解殼聚糖和殼寡糖的制備方法和果蔬采后保鮮應(yīng)用提供參考。

1 殼聚糖、殼寡糖生物活性及功能

1.1 殼聚糖

甲殼素（幾丁質(zhì)）多存在于甲殼類動(dòng)物如蝦、蟹及真菌類中，結(jié)構(gòu)同纖維素一樣高度有序，產(chǎn)量?jī)H次于纖維素，是目前僅有的堿性多糖[1-4]。殼聚糖（chitosan， CS）是甲殼素經(jīng)脫乙酰作用獲得的產(chǎn)物，脫乙酰度為40%～98%，分子量范圍為5×104～2×106 Da[5]。其結(jié)構(gòu)為殼二糖組成的復(fù)雜雙螺旋結(jié)構(gòu)，富含2-乙酰氨基葡萄糖胺和2-氨基葡萄糖[6]。Sajomsang等[7]研究發(fā)現(xiàn)脫乙酰化的程度直接影響殼聚糖中游離氨基和羥基的比例，分子中活潑的氨基和羥基賦予其優(yōu)于幾丁質(zhì)的溶解性、生物相容性、生物降解性、成膜性及其它化學(xué)反應(yīng)活性。但是，Zhang等[8]認(rèn)為殼聚糖的生物活性及功能是由乙?；潭扰c分子量共同決定的，并因其在采后果蔬保藏方面表現(xiàn)出高效、低殘留、對(duì)非目標(biāo)物低毒或無(wú)毒的特點(diǎn)，現(xiàn)已受到廣泛關(guān)注。

1.2 殼寡糖的生物活性及功能

殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）是由N-乙酰基-葡糖胺（A-單元）和D-葡糖胺（D-單元）兩種結(jié)構(gòu)單元組成的線性低聚物[9，10]，即殼聚糖經(jīng)降解后聚合度在2～20、平均分子量低于3 900 Da的產(chǎn)物。其理化性質(zhì)及生物活性優(yōu)于殼聚糖，具有更高的溶解度、生物相容性、生物降解能力、抑菌活性、抗氧化能力等特性，以及更低的粘度。研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖具有更廣泛的生物應(yīng)用范圍：在醫(yī)學(xué)方面，Yang等[11]表明殼寡糖可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)移來(lái)降低膽固醇;在農(nóng)業(yè)方面，殼寡糖與ε-聚-L-賴氨酸聯(lián)合使用能夠代替合成殺菌劑，具有明顯的抗植物病原菌Botritis cinerea的活性[12];此外，Zong等[13]在食用油菜葉片上噴施殼寡糖，發(fā)現(xiàn)它通過(guò)促進(jìn)油菜葉片抗氧化酶活性和改變鎘的分布，明顯改善了鎘脅迫引起的作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降;在食品工業(yè)方面，殼寡糖的成膜性可被用作食品保鮮薄膜[14]。

2 殼聚糖和殼寡糖的制備方法

制備殼聚糖及殼寡糖的方法多種多樣，不同方法制備的兩種多糖的物理化學(xué)性質(zhì)以及生物活性各不相同。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間探索，較常用的是化學(xué)法、酶法和物理法。用40%KOH溶液在90℃條件下處理蝦殼6 h，可獲得脫乙酰度達(dá)78%、平均分子量為6 273 Da的殼聚糖[15]。在pH值6.0、溫度60℃條件下，用濃乙酸鈉洗滌蘇云金芽孢桿菌能夠獲得殼聚糖分解活性，55 h內(nèi)可將600～800 kDa、脫乙酰度（DD）≥ 90%的10 g/L殼聚糖溶液完全轉(zhuǎn)化為寡糖，大部分聚合度在2～5之間[16]。用電子束等離子體處理蟹殼幾丁質(zhì)和殼聚糖固體粉末，可得到Mw為 800～2 000 Da、聚合度在1.5～2.5的殼寡糖，產(chǎn)率達(dá)95%，該多糖可抑制各種酵母和絲狀真菌的生長(zhǎng)，最低抑制濃度為0.5 mg/mL[17]。

相較于化學(xué)物理制備法，用酶來(lái)制備殼聚糖及殼寡糖的反應(yīng)條件較溫和。由于使用的化學(xué)試劑少，對(duì)環(huán)境的污染小，越來(lái)越多的科研工作者更青睞使用酶法來(lái)制備兩種多糖。Zhang等[18]利用幾丁質(zhì)酶水解未經(jīng)預(yù)處理的家蠅幼蟲(chóng)粉，所得產(chǎn)物殼寡糖的聚合度在2～6之間，表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活性，孵育3 d最大產(chǎn)量為158.3 μg/mL;Xie等[19]用纖維素酶將80%脫乙酰度的殼聚糖分解，得到聚合度在3～11的殼寡糖，進(jìn)一步研究得到聚合度為6～11的殼寡糖，得率高達(dá)55%;Lü等[20]將乳酸乳球菌的重組幾丁質(zhì)酶通過(guò)大腸桿菌過(guò)表達(dá)，用該酶水解工業(yè)生產(chǎn)中廢棄的真菌菌絲體中的甲殼素，產(chǎn)物殼寡糖純度可達(dá)70%，結(jié)合使用蝸牛酶時(shí)，產(chǎn)量和產(chǎn)物純度增大。

為了獲得更高的制備效率和生物活性，常把幾種制備方法結(jié)合使用，如化學(xué)-酶法、物理-酶法、物理-化學(xué)法等。將魷魚骨進(jìn)行物理法即壓縮-膨化預(yù)處理后進(jìn)一步提取殼聚糖，相較傳統(tǒng)的熱化學(xué)強(qiáng)堿提取法更環(huán)保，提取的低聚糖提取率與抗菌活性更高[21]。Sánchez等[22]認(rèn)為先通過(guò)化學(xué)降解再酶解，可獲取63%全脫乙酰的寡糖序列，可有效抑制大腸桿菌和李斯特菌，而單純通過(guò)殼聚糖酶解的產(chǎn)物只含有27%全脫乙酰的寡糖序列，僅存較少比例的游離氨基序列以及乙?；鶊F(tuán)能增強(qiáng)殼寡糖分子的抗菌效力。

3 殼聚糖及殼寡糖抑菌活性

不同分子量、脫乙酰度的殼聚糖和殼寡糖對(duì)病原細(xì)菌與病原真菌的抑制程度具有很大差異，pH值的變化對(duì)其抑菌效應(yīng)也存在較大影響。高分子量的殼聚糖不能進(jìn)入微生物體內(nèi)，僅附著在細(xì)胞表面，但在低pH值時(shí)可與細(xì)胞膜上負(fù)電荷相互作用引起膜裂解，使其釋放內(nèi)容物，導(dǎo)致微生物死亡，還可以阻斷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸或者螯合部分對(duì)微生物生長(zhǎng)有益的金屬離子影響微生物生長(zhǎng)，也可使正常進(jìn)行有氧呼吸的細(xì)胞因缺氧而抑制生長(zhǎng)。較低分子量的殼聚糖及殼寡糖能夠進(jìn)入細(xì)胞作用于DNA，抑制mRNA與蛋白質(zhì)的合成，引起細(xì)胞生理生化指標(biāo)的改變，而其脫乙?；皆礁吆挠坞x氨基數(shù)目越多，與細(xì)胞膜的作用越強(qiáng)。較低的乙酰度和pH值更利于殼聚糖發(fā)揮其抑菌活性，殼聚糖分子量的降低能增強(qiáng)對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制性，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制關(guān)系正相反;對(duì)真菌抑制試驗(yàn)表明殼聚糖抑菌效應(yīng)取決于被抑制菌的種類，與其特性相關(guān)不大，例如提高殼聚糖的分子量能夠抑制尖孢鐮刀菌正常生長(zhǎng)，降低殼聚糖的乙酰度能抑制鏈格孢菌生長(zhǎng)[23]。因此，殼聚糖與殼寡糖的抑菌效應(yīng)不只取決于其相對(duì)分子質(zhì)量、乙酰化水平，還取決于所作用的微生物種屬。研究表明，殼聚糖與殼聚糖的分子量對(duì)念珠菌屬生物膜的抗真菌活性之間沒(méi)有相關(guān)性，兩種多糖通過(guò)影響微生物生物膜的形成來(lái)影響微生物的生長(zhǎng)發(fā)育，在殼聚糖的作用下，念珠菌屬的生物量和代謝活動(dòng)在粘附和成熟階段分別減少約70%、80%[24]。

為了增強(qiáng)殼聚糖以及殼寡糖的抗菌活性與抑菌廣譜性，多對(duì)它們進(jìn)行化學(xué)改性進(jìn)而研究其復(fù)合物的生物活性。ε-聚賴氨酸-殼聚糖綴合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有抑制活性，綴合物的抗菌活性高于單一的殼聚糖。聚賴氨酸和殼聚糖的質(zhì)量比是影響抗菌效應(yīng)的關(guān)鍵因素，ε-聚賴氨酸的比例越大，抗菌活性越強(qiáng)，二者比例為1∶ 1時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制區(qū)的直徑約為9.19 mm[25]。Tan等[26]研究發(fā)現(xiàn)，含1，2，3-三唑鎓和吡啶鎓基團(tuán)的殼聚糖衍生物溶解度增高、抗真菌效率提高，并在濃度為1.0 mg/mL時(shí)對(duì)炭疽病菌抑制指數(shù)達(dá)98%以上。季銨化殼聚糖衍生物對(duì)灰霉病菌和炭疽病菌顯示出強(qiáng)烈的抑制作用，在濃度為1.0 mg/mL時(shí)抑制效率（>90%）最高，而其抑制效率同樣受分子量的影響，高分子量的季銨化殼聚糖衍生物顯示出更強(qiáng)的抗真菌活性[27，28]。

4 殼聚糖與殼寡糖抑菌機(jī)理

研究人員已對(duì)殼聚糖與殼寡糖對(duì)微生物的抑制機(jī)理做出假說(shuō)并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，包括對(duì)被作用微生物結(jié)構(gòu)組成、關(guān)鍵酶活性、基因表達(dá)等生理生化指標(biāo)變化的測(cè)定。目前普遍認(rèn)可的抑菌機(jī)理有以下四種：

第一，抗菌活性來(lái)自其氨基（NH2）的正電荷（NH+3）。當(dāng)pH ? ? 第二，殼聚糖分子降解產(chǎn)物可以通過(guò)多層交聯(lián)的胞壁到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，作用于微生物的DNA，抑制mRNA和蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)的變化，影響微生物生長(zhǎng)[30，34-36]。閆佳琪等[37]研究殼聚糖涂層加二氧化氯對(duì)酶活性影響發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的活性均受到明顯抑制。

第三，殼聚糖可以螯合金屬離子。當(dāng)pH>pKa（6.3）時(shí)，殼聚糖具有優(yōu)異的金屬陽(yáng)離子吸收螯合能力，能夠與含有陰離子的細(xì)菌膜相互作用，改變細(xì)菌表面形態(tài)、增加膜滲透性、導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，還可以降低膜滲透性、防止?fàn)I養(yǎng)運(yùn)輸，或者形成不透氣涂層、抑制微生物生長(zhǎng)[5，29，31，38，39]。

第四，殼聚糖的聚合成膜特性使其能夠在細(xì)胞表面形成一層薄膜。該膜在阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的同時(shí)還可阻止氧氣進(jìn)入，從而抑制好氧微生物生長(zhǎng)[40，41]。

5 殼聚糖-殼寡糖果蔬采后保鮮作用

人體食用新鮮果蔬可補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但是果蔬采后不易儲(chǔ)藏或儲(chǔ)藏時(shí)間短，易出現(xiàn)因水分流失、呼吸作用劇烈、病原微生物侵染以及衰老相關(guān)基因表達(dá)等引起的失水皺縮、腐爛變質(zhì)等現(xiàn)象。殼聚糖與殼寡糖是天然無(wú)毒的生物保鮮劑，具有成膜性和廣譜抑菌活性，能在果蔬表面形成具有選擇性透過(guò)膜的同時(shí)抑制果蔬呼吸速率和病原微生物生長(zhǎng)。Devlieghere等[40]發(fā)現(xiàn)殼聚糖涂層加28 mg/L二氧化氯可明顯抑制冷藏期間鮮切竹筍微生物（總需氧菌、酵母菌、霉菌）生長(zhǎng)，也可保持竹筍較高品質(zhì)，延緩褐變和木質(zhì)化進(jìn)程，顯著抑制苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的活性，調(diào)節(jié)竹筍代謝活動(dòng)。Xing等[42]認(rèn)為殼聚糖與殼寡糖能夠誘導(dǎo)果蔬產(chǎn)生抗微生物信號(hào)分子，這些信號(hào)分子通過(guò)改變與抗病相關(guān)的次生代謝物含量來(lái)提高果蔬對(duì)病害的抵抗能力，或者誘導(dǎo)果蔬產(chǎn)生保護(hù)自身抗性。Sun等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ε-聚賴氨酸與殼寡糖組合能夠誘導(dǎo)采后番茄水楊酸、苯丙氨酸和茉莉酸水平增加，提高氨裂解酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，降低過(guò)氧化氫酶活性和脫落酸、赤霉素水平，從而增加采后番茄貨架期。

目前，因殼聚糖與殼寡糖對(duì)非目標(biāo)物無(wú)毒，已被廣泛應(yīng)用于多種果蔬：甘薯、綠蘆筍、番茄、鱷梨、草莓等[12， 35， 37， 42，43]的保鮮過(guò)程中（表1）。相關(guān)應(yīng)用研究表明，使用2 mg/mL殼聚糖處理甘薯塊根，對(duì)甘薯黑斑病菌抑制率可達(dá)87.02%，并能夠完全抑制病原菌孢子萌發(fā)甚至致其死亡[42];閆佳琪等[37]用1.5%（w/v）的殼聚糖溶液處理采后鱷梨發(fā)現(xiàn)，處理后的果實(shí)基因表達(dá)變化明顯，7 d保質(zhì)期內(nèi)的果實(shí)硬度較高，質(zhì)地、肉色、味道等的接受度較高;Qiu等[43]發(fā)現(xiàn)高分子量與低分子量的殼聚糖在濃度為4 mg/mL時(shí)可有效抑制采后綠蘆筍中分離得到的鐮刀菌生長(zhǎng)，濃度為0.05 mg/mL時(shí)完全抑制鐮刀菌孢子萌發(fā)，并且對(duì)非目標(biāo)物無(wú)毒，可使綠蘆筍在28 d的冷藏期間保持良好品質(zhì);Gao等[46]使用肉桂醛-殼聚糖涂層可明顯延緩采后臍橙質(zhì)量下降速度;Duran等[45]將殼聚糖復(fù)合抗菌劑如乳酸鏈球菌肽、游霉素、石榴和葡萄籽提取物應(yīng)用于新鮮草莓保鮮，果實(shí)質(zhì)量改善明顯并延長(zhǎng)30 d的保質(zhì)期;Perdones等[47]用1%高分子量殼聚糖和3%檸檬油制成的復(fù)合涂料可以減緩草莓呼吸速率并能夠有效抑制番茄灰霉病菌，對(duì)采后新鮮草莓保質(zhì)期的延長(zhǎng)效果顯著;200 mg/L ε-PL與400 mg/L COS組合具有最佳的體外抗真菌活性和誘導(dǎo)抗性，對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率高達(dá)90.22%[12]。

6 展望

殼聚糖-殼寡糖在理化性質(zhì)、生物活性等方面存在限制因素，致使其在果蔬保鮮方面的應(yīng)用受到諸多限制[49]。但曹麗娟等[50]研發(fā)的殼聚糖抑菌可食用保鮮膜大大提高了抑菌效果，增強(qiáng)了殼聚糖及其衍生物的抑菌效應(yīng)，一定程度上擴(kuò)大了抑菌廣譜性，為殼聚糖-殼寡糖的應(yīng)用開(kāi)辟了新途徑。因此，本研究建議加強(qiáng)殼聚糖等多種多糖與金屬離子、多聚鹽、抗菌劑、精油等相結(jié)合的復(fù)合新型保鮮膜的研發(fā)，從而更好地為滿足農(nóng)產(chǎn)品保鮮對(duì)綠色、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用保鮮技術(shù)的需求提供保障。

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