茶樹(shù)4-香豆酸輔酶A連接酶基因Cs4CL1的克隆與蛋白表達(dá)分析

高榮廣　李昊　向勤锃　李敏

摘要：4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）是木質(zhì)素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。本試驗(yàn)以‘福鼎大白茶樹(shù)為材料，克隆得到Cs4CL1基因，該基因長(zhǎng)度為1 715 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度1 623 bp，編碼540個(gè)氨基酸。氨基酸同源性分析顯示，Cs4CL1蛋白具有植物4CL酶的典型特征，即AMP結(jié)合功能域和GEICIRG保守區(qū)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，Cs4CL1蛋白與藍(lán)果樹(shù)、煙草、番茄等植物的4CL1蛋白聚為一類，屬于4CL亞家族A。利用原核表達(dá)系統(tǒng)可誘導(dǎo)出具有活性的Cs4CL1重組蛋白，該蛋白大小為78 kD。本研究為深入解析Cs4CL1在茶樹(shù)木質(zhì)素合成途徑中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù);木質(zhì)素;Cs4CL1基因;Cs4CL1蛋白;同源性分析;原核表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S571.103：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）03-0008-05

Abstract 4-Coumarate coenzyme A ligase （4CL） is the key enzyme in lignin biosynthesis. In this study， the 4-coumarate coenzyme A ligase gene Cs4CL1 was cloned from tea variety Fuding-Dabaicha. The length of Cs4CL1 was 1 715 bp including 1 623 bp open reading frame and encoding 540 amino acids. Amino acid sequence homology analysis showed that Cs4CL1 protein had typical characteristics of 4CL enzyme as AMP combined function domain and GEICIRG conserved region. Phylogenetic analysis showed that Cs4CL1 protein was clustered with 4CL1 proteins of Nyssa sinensis， Nicotiana tabacum， Solanum pennellii and other plants， belonging to 4CL subfamily A. Additionally， a 78 kD Cs4CL1 recombinant protein with high biological activity was induced in prokaryotic expression system. The results laid bases for further analyzing the function of Cs4CL1 gene in tea tree.

Keywords Tea tree; Lignin; Cs4CL1 gene; Cs4CL1 protein; Homology analysis; Prokaryotic expression analysis

嫩度是衡量茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，幼嫩的鮮葉適制名優(yōu)茶[1]。茶樹(shù)新梢持嫩性與木質(zhì)素含量負(fù)相關(guān)[2]。

木質(zhì)素是植物體內(nèi)的生物大分子，具有增強(qiáng)細(xì)胞壁硬度的重要生物學(xué)功能。它在植物體內(nèi)的生物合成由苯丙氨酸解氨酶 （phenylalanine ammonia-lyase， PAL）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL）、肉桂醇脫氫酶 （cinnamyl alcohol dehydrogenase， CAD） 等多個(gè)酶催化[3]。其中，4CL是合成途徑的限速酶，其功能研究備受關(guān)注。目前，科研工作者已在擬南芥[4]、大豆[5]、茶樹(shù)[6]、火炬松[7]、美洲山楊[8]、煙草[9]、水稻[10]、碭山酥梨[11]等植物中鑒定出4CL基因。根據(jù)遺傳進(jìn)化分析，不同植物的4CL基因分為亞家族A和亞家族B[12]。4CL亞家族A包括擬南芥的At4CL1和At4CL2基因，雜種楊的Ptd4CLl、Ptd4CL2和Pt4CLl基因;擬南芥At4CL3和楊樹(shù)Pt4CL2歸類為4CL亞家族B。研究發(fā)現(xiàn)，亞家族A的4CLs具有促進(jìn)木質(zhì)素生物合成的功能[13]， 當(dāng)擬南芥4CL基因的表達(dá)被抑制后，體內(nèi)木質(zhì)素含量顯著降低[14]。亞家族B主要參與類黃酮的生物合成[15]，茶樹(shù)4CL是調(diào)節(jié)兒茶素合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因[6]。植物中的4CL存在多種同工酶，已相繼從甜高粱、棉花、水稻中誘導(dǎo)出4CL蛋白[3，16，17]。

目前鮮有關(guān)于茶樹(shù)持嫩性的研究，并且分析和衡量茶葉嫩度的方法不明確，致使相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。因此，本試驗(yàn)從‘福鼎大白茶樹(shù)中克隆Cs4CL1基因，并進(jìn)行Cs4CL1蛋白誘導(dǎo)，旨在為深入研究該基因的表達(dá)及其編碼蛋白在茶樹(shù)持嫩性中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用‘福鼎大白（Camellia sinensis cv. Fuding-Dabai Cha）茶樹(shù)一芽二葉采自泰安市岱岳區(qū)茶溪谷，液氮速凍后置-80℃保存?zhèn)溆谩?.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成使用OminiPlant RNA Kit（DNase Ⅰ）提取試劑盒（康為世紀(jì)產(chǎn)品）提取‘福鼎大白一芽二葉總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和完整性。采用 TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Cs4CL1基因克隆

利用UltraEdit從茶樹(shù)基因組中搜索4CL核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：Cs4CL1-F（5′-TTCCATAACAACCGAACAACATAT-3′）、Cs4CL1-R（5′-ATACGAGCAGCTACTCATGCT-3′）。以cDNA為模板擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：模板1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30 s;98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán);72℃后延伸5 min，16℃ 5 min。利用天根凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并將回收的目的片段連入pMD18-T載體，經(jīng)氨芐抗生素篩選后，挑選陽(yáng)性克隆送青島生工生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證。1.4 Cs4CL1氨基酸同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建利用DNAMAN軟件（version 5.2.2）進(jìn)行Cs4CL1氨基酸多重序列比較和同源性分析。采用MegaX軟件（version 10.0.5），構(gòu)建4CL系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用ClustalW多重比對(duì)、最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony， MP）和隨機(jī)逐步比較方式。1.5 Cs4CL1蛋白的原核表達(dá)分析

將帶有酶切位點(diǎn)的Cs4CL1基因連入原核表達(dá)載體pET32a（+），轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）;篩選陽(yáng)性克隆，37℃活化菌體直至菌液OD值達(dá)到0.6～0.8，添加0.5 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），28℃誘導(dǎo)6 h;利用超聲波破碎細(xì)胞，離心取上清，沉淀用8 mol/L尿素溶解，最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cs4CL1基因的克隆

本試驗(yàn)以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的條帶如圖1所示，片段長(zhǎng)度約為1 700 bp。經(jīng)測(cè)序分析可知，該基因全長(zhǎng)1 715 bp，編碼區(qū)序列長(zhǎng)度1 623 bp，編碼540個(gè)氨基酸。

2.2 Cs4CL1氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

Cs4CL蛋白具有植物4CL酶的典型特征，包含保守的AMP結(jié)合功能域（185～197氨基酸序列）和GEICIRG保守區(qū)（384～390氨基酸序列），見(jiàn)圖2。采用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)該蛋白分子量約為55 kD。 BOXⅠ表示保守的AMP結(jié)合功能域，BOXⅡ表示GEICIRG保守區(qū);甜椒 （Capsicum annuum），風(fēng)鈴辣椒 （Capsicum baccatum），黃燈籠椒 （Capsicum chinense），茶樹(shù) （Camellia sinensis），水曲柳 （Fraxinus mandshurica），野生煙草 （Nicotiana attenuata），藍(lán)果樹(shù) （Nyssa sinensis），煙草 （Nicotiana tabacum），矮牽牛 （Petunia hybrida），潘那利番茄 （Solanum pennellii），馬鈴薯 （Solanum tuberosum），下同。

由圖3可以看出，Cs4CL蛋白與藍(lán)果樹(shù)、煙草、番茄等植物的4CL1蛋白聚為一類，進(jìn)化過(guò)程中與藍(lán)果樹(shù)、水曲柳的親緣關(guān)系較近。因此，我們克隆的Cs4CL屬于4CL亞家族A，并命名為Cs4CL1，其與‘舒茶早茶樹(shù)的Cs4CL聚成一小類。

橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）;可可 （Theobroma cacao）;枸杞 （Lycium chinense）;垂枝樺 （Betula pendula）;芒果（Mangifera indica）;葡萄 （Vitis vinifera）;芝麻 （Sesamum indicum）;大豆 （Glycine max）;香橙（Citrus junos）。

2.3 Cs4CL1蛋白誘導(dǎo)及可溶性分析

Cs4CL1重組菌體誘導(dǎo)6 h后經(jīng)超聲破碎，分別取上清和沉淀，經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果如圖 4 所示，與0 h相比，誘導(dǎo)6 h后的Cs4CL1重組蛋白目的條帶明顯，上清和沉淀中均有明顯的Cs4CL1重組蛋白條帶。蛋白條帶大小在75～80 kD 之間。

3 討論與結(jié)論

木質(zhì)素影響茶樹(shù)組織細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和葉片韌性，量高會(huì)導(dǎo)致葉片老化、嫩度變差[1]，嚴(yán)重影響茶葉品質(zhì)。木質(zhì)素生物合成包括3條途徑：一是苯丙烷代謝途徑，二是木質(zhì)素合成特異途徑，三是木質(zhì)素合成下游途徑。4-香豆酸輔酶A連接酶是連接苯丙烷途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶[17，18]。擬南芥中反義表達(dá)4CL基因可使4CL酶活性明顯下降，S-木質(zhì)素含量下降[19]。煙草中異源表達(dá)毛白楊4CL基因的啟動(dòng)子，可顯著提高莖木質(zhì)部4CL基因表達(dá)量，使木質(zhì)素含量比對(duì)照提高25%左右[20]。本試驗(yàn)以持嫩性較好的‘福鼎大白為研究對(duì)象，克隆了Cs4CL1基因，序列分析結(jié)果表明，Cs4CL1基因含有1 623 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼540個(gè)氨基酸。氨基酸同源序列分析結(jié)果表明，‘福鼎大白Cs4CL1與其它物種4CL蛋白氨基酸序列相似性較高，Cs4CL1具有4-香豆酸輔酶 A 連接酶的典型結(jié)構(gòu)特征，即AMP結(jié)合功能域和GEICIRG保守區(qū)，表明在不同物種和不同類型4CL同工酶之間存在較高的序列上的保守性。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，Cs4CL1與不同植物中的4CL1同源性較高，同屬為4CL亞家族A;Cs4CL1與‘舒茶早茶樹(shù)的Cs4CL聚成一小類，二者可能是由同一祖先進(jìn)化而來(lái)的分支。

蛋白原核表達(dá)分析結(jié)果表明，重組Cs4CL1蛋白條帶長(zhǎng)度約78 kD， His標(biāo)簽蛋白分子量約23 kD，因此Cs4CL1蛋白約為55 kD，這與預(yù)測(cè)的Cs4CL1蛋白分子量一致，說(shuō)明Cs4CL1蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá);誘導(dǎo)后上清和沉淀中均有重組Cs4CL1蛋白的表達(dá)，表明我們獲得了具有活性的Cs4CL1蛋白。本研究結(jié)果為后續(xù)深入研究Cs4CL1在茶樹(shù)木質(zhì)素合成過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)，可為解析茶樹(shù)持嫩性、改善茶葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。