?高效液相色譜法測定藍(lán)莓果中花色苷含量?

何金格 王政 鄧潔紅

摘 要：采用高效液相色譜法建立了藍(lán)莓果中花色苷的定量分析方法。藍(lán)莓樣品經(jīng)酸化乙醇超聲提取，色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為酸性較強(qiáng)的2%甲酸水溶液（A）和2%甲酸乙腈溶液（B），檢測波長為520 nm，花色苷含量以飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的含量表示。結(jié)果表明：飛燕草素-3-O-葡萄糖苷在1.0～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2=0.999 8）;藍(lán)莓果中飛燕草素-3-O-葡萄糖苷回收率為92.61%，RSD為0.75%，且樣品中花色苷物質(zhì)分離度、精密度均良好;檢測限和定量限分別為0.1和0.5 μg/mL。經(jīng)測定，燦爛、圓藍(lán)、巴爾德溫這3個(gè)藍(lán)莓品種中圓藍(lán)品種花色苷含量最高。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;藍(lán)莓果;花色苷;測定方法

中圖分類號：O657.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2020）05-0068-04

Determination of Anthocyanin in Blueberry by High Performance Liquid Chromatography

HE Jing-ge1，WANG Zheng1，2，DENG Jie-hong1，2

（1. College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128，PRC; 2. Hunan Provincial Research

Center of Engineering and Technology for Fermented Food， Changsha 410128， PRC）

Abstract： The quantitative analysis method of anthocyanins in blueberry fruit was established by high performance liquid chromatography （HPLC）. Blueberry samples were extracted by acidification ethanol ultrasonic method. The chromatographic column was C18， the mobile phase was 2% formic acid aqueous solution （A） and 2% formic acid acetonitrile solution （B）. The detection wavelength was 520 nm. The content of anthocyanin was expressed by the content of delphinidin-3-O-glucoside. The results showed that the linear relationship of delphinidin-3-O-glucoside was good in the concentration range of 1.0-100 μg/mL （R2 = 0.999 8）. The recovery of delphinidin-3-O-glucoside in blueberry fruit was 92.61%， RSD was 0.75%， and the separation and precision of anthocyanins were good. The detection limit and quantitative limit were 0.1 and 0.5μg/mL， respectively. Among the three blueberry varieties Canlan， Yuanlan and Baldwin， the content of anthocyanin in Yuanlan is the highest.

Key words： high performance liquid chromatography; blueberry fruit; anthocyanin; determination method

藍(lán)莓（Blueberry）又稱越橘、藍(lán)漿果，杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）多年生落葉或常綠灌木，果實(shí)為漿果，近圓形，呈藍(lán)色，酸甜適度，果肉細(xì)膩，皮薄籽小[1-2]。藍(lán)莓的花色苷（Anthocyanins）含量居于水果和蔬菜之首，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織譽(yù)為“黃金漿果”[3]?；ㄉ帐屈S酮類化合物，廣泛存在于植物的根莖葉花果實(shí)等器官的細(xì)胞液中，使其呈現(xiàn)出紅色藍(lán)色或紫色等顏色，是自然界重要的水溶性的色素之一，分布于27個(gè)科，72個(gè)屬的植物中[4]?；ㄉ詹粌H賦予植物鮮艷的顏色以利于授粉和種子傳播、抵抗植物蟲害[4]以及預(yù)防植物的紫外線照射損傷[5]，而且具有重要的生物活性功能，如抗氧化活性、抗癌活性、抗動(dòng)脈硬化活性[6]、降低血脂[7]、減少肝損傷[8]和降血糖活性[9]等。

花色苷屬于天然的食用色素，且生理活性對人體具有重要的保健功能，得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究，并且在食品、藥品、保健品和化妝品等方面的應(yīng)用十分廣泛。目前花色苷含量測定方面的研究比較多，主要是采用pH示差法測定總花色苷含量，而高效液相色譜法具有能夠準(zhǔn)確測量單一組分和將花色苷物質(zhì)良好分離的優(yōu)點(diǎn)。林麗等[10]利用大孔樹脂分離純化，運(yùn)用高效液相色譜法，快速準(zhǔn)確地測定黑果枸杞提取物中的花色苷主要成分物質(zhì)矮牽牛素-5-O-葡萄糖苷含量。趙珊等[11]采用鹽酸甲醇溶液超聲提取有色稻米花色苷，以超高效液相色譜-紫外檢測器對有色稻米中主要花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷進(jìn)行定量檢測。筆者在前人研究[12-15]的基礎(chǔ)，以張家界引種的藍(lán)莓品種為研究對象，重點(diǎn)研究高效液相色譜法測定藍(lán)莓果中花色苷（以飛燕草素-3-O-葡萄糖苷計(jì)）的相對含量，以期對果實(shí)品質(zhì)的評價(jià)和深加工等方面的研究提供數(shù)據(jù)參考，也為藍(lán)莓果中花色苷單體的分離和制備提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藍(lán)莓樣品為燦爛、圓藍(lán)、巴爾德溫這3種，均來源于張家界藍(lán)莓生產(chǎn)基地，2017年7月購回后于-40℃凍藏備用。

主要試劑有飛燕草素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥95%）、乙醇（分析純）、甲酸（分析純）、鹽酸（分析純）、乙腈（色譜純，EMD Millipore Corporation）、甲醇（色譜純，EMD Millipore Corporation）和分析純化水。

主要儀器設(shè)備有LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）、梅特勒電子天平（感量0.1 mg）、9960A型超聲波清洗器（天津科貝爾有限公司）、移液槍（eppendorf，規(guī)格10～100 μL和0.5～5 mL）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：準(zhǔn)確稱取飛燕草素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg（精確到0.1 mg），用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，即為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20℃下，貯存于密封的棕色玻璃瓶中。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.1、0.25、0.5、1.25、2.5和5.0 mL于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸水稀釋至刻度，搖勻即得系列濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 μg/mL的花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.2.2 花色苷提取液的制備 準(zhǔn)確稱取藍(lán)莓果5 g記錄其質(zhì)量，（精確至0.1 mg），研磨，加入50 mL 70%的乙醇溶液（添加0.1%鹽酸），于50℃下超聲50 min，冷卻后，將藍(lán)莓果花色苷粗提液經(jīng)抽濾后，置于50℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，用0.1%甲酸水定容至50 mL，搖勻經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，上機(jī)，進(jìn)樣體積為50 μL。

1.2.3 色譜條件優(yōu)化 采用紫外-可見光全波段（250～800 nm）掃描，以確定最佳檢測波長。研究表明，花色苷在低pH值條件下分離較好，因此流動(dòng)相選擇酸性較強(qiáng)的2%甲酸水溶液（A）和2%甲酸乙腈溶液（B）。色譜柱為穩(wěn)定性好的C18色譜柱（CAPCELL?PAK，4.6 μm×250 mm，5 μm）。采用二元梯度洗脫，洗脫程序如下：0～15 min，5%～15%B;15～20 min，15%B;20～27 min，15%～40%B;27～28 min，40%～100%B;28～33 min，100%B;33～48 min，100%～5%B。柱溫40℃，流速0.6 mL/min，時(shí)間50 min。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 μg/mL的花色苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，依次進(jìn)高效液相色譜儀檢測，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)樣體積為50 μL。

1.2.5 方法驗(yàn)證 （1）精密度。取濃度為25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行6次平行測定，進(jìn)樣體積為50 μL，計(jì)算飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的保留時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。（2）回收率。稱取3份5 g（精確至0.1 mg）藍(lán)莓果（圓藍(lán)品種），研磨后置50 mL容量瓶中，在樣品中加入飛燕草素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.0和5.0mL（200 μg/mL），每個(gè)濃度做3個(gè)平行測定。（3）檢出限和定量限。精密量取50.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL分別置于50 mL容量瓶中，記錄相應(yīng)保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰高，與基線噪音峰高之比，以信噪比為3∶1來確定最低檢出限，10∶1來確定定量限。

1.2.6 不同藍(lán)莓品種中花色苷含量的測定 以1.2.3的方法對張家界地區(qū)的燦爛、圓藍(lán)、巴爾德溫這3個(gè)品種的藍(lán)莓果進(jìn)行花色苷測定，花色苷總量以飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的含量表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

如圖1所示，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷在280 nm及520 nm左右，均有最大吸收峰，為排除280 nm處其他黃酮類物質(zhì)的干擾，試驗(yàn)確定最佳檢測波長為520 nm。

2.2 液相條件的確定

通過色譜條件優(yōu)化，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品在22.298 min處有最大值（圖2），峰形完整。由圖3可知，藍(lán)莓果樣品在C18色譜柱分離下一共有13個(gè)峰，各峰保留時(shí)間主要集中在20～35 min之間，且分離度良好。

2.3 方法線性

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的線性回歸方程為y=60 017 x-2 164.3，R2=0.999 8，表明在1.0～100.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 精密度 如表1所示，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的保留時(shí)間的RSD為0.11%，峰面積的RSD為1.21%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 回收率 由表2可知，飛燕草素-3-O-葡萄糖

2.4.3 檢出限和定量限 經(jīng)檢測，采用該方法，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的檢出限為0.1 μg/mL，定量限為0.5 μg/mL。當(dāng)稱樣量為5.0 g，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的檢出限1.0 mg/kg，定量限為5.0 mg/kg。

2.5 樣品測定結(jié)果

經(jīng)測定，燦爛、圓藍(lán)、巴爾德溫這3個(gè)藍(lán)莓品種的飛燕草素-3-O-葡萄糖苷含量分別為25、740和40 mg/kg，表明圓藍(lán)品種中花色苷含量最高。

3 結(jié) 論

研究采用酸純化乙醇超聲提取藍(lán)莓果中花色苷，以藍(lán)莓果主要成分物質(zhì)飛燕草素-3-O-葡萄糖苷為目標(biāo)，建立高效液相色譜法測定藍(lán)莓果中花色苷的相對含量。藍(lán)莓果中飛燕草素-3-O-葡萄糖苷濃度在1.0～100 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，R>0.999 8，且回收率為92.61%，RSD為0.75%，且具有有良好精密度，藍(lán)莓果花色苷物質(zhì)分離度良好，檢出限低，適用于藍(lán)莓果花色苷含量測定，并且該方法對于藍(lán)莓果花色苷的成分鑒定和花色苷單體的制備和分離提供了一定的參考價(jià)值。經(jīng)測定，3個(gè)藍(lán)莓品種中圓藍(lán)品種花色苷含量最高。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）

收稿日期：2020-03-19

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金（2018JJ2168）

作者簡介：何金格（1990—），女，湖南衡陽市人，碩士研究生，專業(yè)：食品加工與安全。

通信作者：鄧潔紅