Chia-Pet技術(shù)與應(yīng)用研究

許立

摘要：特定DNA調(diào)控元件之間的長距離染色質(zhì)接觸在基因表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，在理解信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞狀態(tài)時(shí)，必須對(duì)這些三維（3D）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的相互作用進(jìn)行全局表征。利用成對(duì)末端標(biāo)記序列（Chia-Pet）進(jìn)行染色質(zhì)相互作用分析是一種將功能染色質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為數(shù)百萬個(gè)短標(biāo)記序列的方法。自2009年開發(fā)以來，在染色質(zhì)相互作用分析中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，從而為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究提供了新的視角。本文介紹了Chia-Pet的實(shí)驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)分析過程，分析了幾種常用工具各自的特點(diǎn)和適用范圍，幫助研究人員選用合適的方法以獲得更可靠的結(jié)果。

關(guān)鍵詞： 基因表達(dá)調(diào)控; 三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu); Chia-Pet

【Abstract】 Long-distance chromatin contact between specific DNA regulatory elements plays a key role in gene expression regulation. Global characterization of the interactions in these three-dimensional （3D） chromatin structures is essential in understanding signal networks and cell states. Chromatin interaction analysis using Paired-End-Tag sequencing （Chia-Pet） is a method for transforming functional chromatin structures into millions of short labeling sequences. Since its development in 2009， it has unique advantages in chromatin interaction analysis， which provides a new perspective for the study of transcriptional regulation. This paper introduces the experimental scheme and data analysis process of Chia-Pet， analyses the characteristics and application scope of several commonly used tools， and helps researchers choose appropriate methods to obtain more reliable results.

【Key words】 ?gene expression regulation; three-dimensional chromatin structures; Chia-Pet

0 引 言

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是真核生物中一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，其中染色質(zhì)相互作用起著關(guān)鍵作用，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并進(jìn)一步影響其他細(xì)胞的活動(dòng)。許多研究轉(zhuǎn)錄因子（tf）與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的結(jié)合的技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來。例如染色質(zhì)免疫沉淀（chip）微陣列（chip chip）[1]、chip pet[2]和chip seq[3]，但卻無法確定遠(yuǎn)端tf結(jié)合位點(diǎn)的靶基因。另一個(gè)挑戰(zhàn)是確定這種遠(yuǎn)端結(jié)合位點(diǎn)是否具有功能性，即通過染色體環(huán)在物理上接近靶基因啟動(dòng)子，或吸引RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄。因此，鑒定全基因組遠(yuǎn)端染色質(zhì)相互作用，將調(diào)控元件引導(dǎo)至目標(biāo)基因，可能為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究提供新的視角。染色體構(gòu)象捕獲（3c）[4]及其衍生物，4c[5-6]和5c[7]可以揭示參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的長程染色質(zhì)相互作用，但這些技術(shù)受到限制，或者是因?yàn)槠湔w性較低，如3c，或者是因其無法在整個(gè)基因組中繪制高分辨率的相互作用區(qū)域[8]。染色質(zhì)相互作用分析與配對(duì)末端標(biāo)記測序（Chia-Pet）方法就能夠符合分析高吞吐量和高分辨率基因組水平上染色質(zhì)相互作用這些要求。與HI-C[9]相比，Chia-Pet在與功能研究相關(guān)的蛋白質(zhì)相關(guān)的更高分辨率上更好，確定TF結(jié)合位點(diǎn)和染色質(zhì)相互作用，為以三維（3D）方式研究長程染色質(zhì)相互作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并提供了更可靠的方式。目前，Chia-Pet已成功應(yīng)用于人MCF7細(xì)胞[10]、人癌細(xì)胞[11]、人T細(xì)胞[12]、小鼠胚胎干細(xì)胞[13]、小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞[14]和小鼠B細(xì)胞[15]以及其他細(xì)胞[16]。

為了系統(tǒng)評(píng)價(jià)Chia-Pet的方法，本文將詳細(xì)探討該方法的實(shí)驗(yàn)方案，與此同時(shí)，為方便后續(xù)研究分析，很多分析Chia-Pet數(shù)據(jù)的計(jì)算方法被提出，本文對(duì)這些計(jì)算方法進(jìn)行了較為全面的研究與論述。

1 Chia-Pet實(shí)驗(yàn)方案介紹

對(duì)端測序的結(jié)果存儲(chǔ)在2個(gè)fastq文件中，可以使用Chia-Pet工具[17]或其他方法[18]進(jìn)行處理。通常，Chia-Pet數(shù)據(jù)處理有7個(gè)步驟（見圖1），分別是：連接子過濾;Pet映射;冗余去除;自連和互連Pet分類;結(jié)合位點(diǎn)分析自連Pet;用互連Pet進(jìn)行染色質(zhì)相互作用分析;染色質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)的可視化。

在第一步中，連接體將與參考半連接體核苷酸序列對(duì)齊。除標(biāo)簽序列外，有2種半連接體，分別命名為A和B，而且具有相同的核苷酸。因此，根據(jù)連接體的組成將PET分為2類：相同的連接體（AA或BB）和不同的連接體（AB或BA）。然后將連接體從原始測序片段中排除，并保留剩余的DNA片段以供進(jìn)一步分析。在連接體過濾后，使用BWA[19]、Bowtie[20]、Batmis[21]或其他繪圖工具將短DNA序列與參考基因組對(duì)齊。使用samtools[22]和bedtols[23]過濾掉冗余和低質(zhì)量的映射序列。自連PET是指從兩端循環(huán)的單個(gè)DNA片段的測序片段，并在同一染色體上的短距離內(nèi)映射到基因組?；ミBPET是指來自不同DNA片段的測序片段，通常2個(gè)標(biāo)簽位于不同染色體中或長距離位于同一染色體中。雖然使用自連PET來確定基因組上的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，但是互連PET可以通過聚類來預(yù)測染色質(zhì)相互作用。在此基礎(chǔ)上還須確保2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的交互集群確實(shí)存在或者是偶然發(fā)生的。Li等人[17]使用基于超幾何分布的Fisher精確檢驗(yàn)來量化相互作用頻率。Paulsen等人[18]提出了一種基于非中心超幾何分布的新統(tǒng)計(jì)模型，該模型將基因組距離依賴關(guān)系考慮在內(nèi)進(jìn)行p值估計(jì)。最后，構(gòu)建Chia-Pet瀏覽器來報(bào)告數(shù)據(jù)并可視化結(jié)合位點(diǎn)以及交互集群。

通過數(shù)據(jù)處理獲得的相互作用需通過濕實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證。短基因組距離中DNA元件間的相互作用可以通過3C實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)于遠(yuǎn)距離相互作用中的DNA片段（位于不同染色體或同一染色體中的兩個(gè)錨點(diǎn)，距離超過100萬堿基對(duì)），可以使用顯微鏡技術(shù)，如DNA熒光原位雜交（DNA-FISH）[24]直接觀察相互作用錨的位置和核中的相對(duì)空間距離。

2 Chia-Pet數(shù)據(jù)分析方法

2.1 Chia-Pet Tool介紹

正如預(yù)期的那樣，這種方法識(shí)別的交互要比CPT少得多。雖然這種方法能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確的交互，但是軟件只執(zhí)行Chia-Pet數(shù)據(jù)分析、交互評(píng)分中的最后一步。因此，用戶必須編寫自己的軟件來查找和刪除鏈接器序列、對(duì)齊寵物、刪除重復(fù)項(xiàng)、調(diào)用峰值、將寵物分組到交互中并確定寵物距離的下限。因此，該軟件僅對(duì)具有重要編程技能的研究人員有用。已經(jīng)描述了其他軟件包，但這些軟件包或者不公開，或者與CPT和Chiasig有類似的限制。

2.3 Mango介紹

Mango[25]將基因組位點(diǎn)間相互作用的可能性作為距離和峰深的函數(shù)進(jìn)行建模，并使用該模型為相互作用分配統(tǒng)計(jì)置信度。值得注意的是，Mango用一種簡單而健壯的貝葉斯方法取代了計(jì)算上昂貴的距離匹配重布線方法。

由于使用方便和準(zhǔn)確性的提高，Mango將通過對(duì)Chia-Pet數(shù)據(jù)集的分析，大幅提升揭示三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特征和功能的能力。同時(shí)也糾正了非特定的相互作用，可以作為一個(gè)基因組接近和峰深的函數(shù)。本次研究證明，與CPT（現(xiàn)有的Chia-Pet分析管道）和Chiasig（為Chia-Pet交互提供統(tǒng)計(jì)置信度估計(jì)的軟件包）相比，Mango表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確性。將Mango應(yīng)用于多個(gè)Chia-Pet數(shù)據(jù)集，可以獨(dú)立復(fù)制與NAT相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。三維染色質(zhì)環(huán)的結(jié)構(gòu)，包括對(duì)具有內(nèi)向基序的CTCF結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)富集。

除了提高準(zhǔn)確性之外，Mango的可用性也頗受青睞。Mango被設(shè)計(jì)成所有的研究人員都可以使用。Mango很容易安裝，只需一個(gè)命令就可以完成從fastq到交互的所有步驟。

2.4 MICC介紹

MICC[26]，一種易于使用的R包，用于處理Chia-Pet數(shù)據(jù)。MICC旨在以高靈敏度檢測染色質(zhì)相互作用，同時(shí)將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）控制在合理水平。 MICC的輸入是源自Chia-Pet數(shù)據(jù)的原始PET簇。 MICC的最終輸出包括：將PET簇描述為真實(shí)相互作用簇的后驗(yàn)概率列表和相應(yīng)的FDR。在不同數(shù)據(jù)集的相同F(xiàn)DR上，MICC總能檢測到比Chia-Pet工具和ChiaSig更多的相互作用。此外，MICC檢測到的相互作用在生物學(xué)重復(fù)之間也更加一致。

2.5 各種工具之間的性能比較

Mango僅依賴4個(gè)廣泛使用且易于安裝的軟件包。相比之下，CPT需要具體的操作系統(tǒng)配置，主要有復(fù)雜的編程語言和環(huán)境陣列，包括C、Perl、Python、R、 Mysql、Apache Web Server和Php，并附帶7頁的安裝指南。Chiasig可以輕松安裝，但只執(zhí)行分析Chia PET數(shù)據(jù)所需的單個(gè)步驟。因此，用戶要編寫自己的代碼來執(zhí)行大多數(shù)處理步驟，包括連接解析、PET映射、冗余去除、峰值調(diào)用和距離過濾，詳見表1。

MICC，從Chia-Pet的數(shù)據(jù)中檢測顯著染色質(zhì)相互作用。與Chia-Pet工具相比，MICC使用較低深度的測序庫恢復(fù)了較高深度測序庫中檢測到的交互作用的顯著比例。同時(shí)，還為寵物集群提供了更一致的排序，從而可以提高實(shí)驗(yàn)復(fù)制之間的再現(xiàn)性。通過與5C數(shù)據(jù)的比較，分析后發(fā)現(xiàn)MICC能比Chiasig更有效地檢測相互作用。此外，MICC檢測到的低PET計(jì)數(shù)的相互作用與5C數(shù)據(jù)有很大的重疊，這表明MICC尋找弱相互作用是可行的。這些特性使MICC優(yōu)于其他現(xiàn)有的工具，特別是在以較少的排序深度處理ChiaPET數(shù)據(jù)時(shí)。

3 Chia-Pet技術(shù)應(yīng)用

3.1 研究DNA片段之間的相互作用

Chip Seq用于分析DNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用，而Chia-Pet則從根本上研究DNA片段之間的相互作用。Fullwood等人[27]使用Chia-Pet技術(shù)構(gòu)建了由人乳腺癌細(xì)胞系MCF7的雌激素受體α（ER-a）結(jié)合的染色質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)長程ER-α結(jié)合位點(diǎn)主要位于啟動(dòng)子區(qū)域。Handoko等人[28]發(fā)現(xiàn)CTCF介導(dǎo)的小鼠胚胎多能干細(xì)胞相互作用。Chia-Pet揭示的5個(gè)不同的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域?yàn)槿旧w結(jié)構(gòu)組織提供了新的CTCF功能模型，并將增強(qiáng)子與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的啟動(dòng)子連接起來。

在描述人類T細(xì)胞中增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用后，Chepelev等人[29]提出增強(qiáng)子以細(xì)胞特異性的方式增加其靶基因的表達(dá)，相互作用的啟動(dòng)子是共存的。此外，細(xì)胞核中的染色體在多個(gè)層次上被組織起來發(fā)揮作用，除CTCF外，還有許多因素可能參與T細(xì)胞的這一過程。在未來的研究中，需要對(duì)詳細(xì)的機(jī)制進(jìn)行探討。

He等人[30]根據(jù)Chip Seq獲得的ER-α結(jié)合峰計(jì)算DNA環(huán)化的可能性，繼而預(yù)測ER-α介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用。這是第一個(gè)使用Chip Seq預(yù)測染色質(zhì)相互作用的工作，為Chia-Pet提供了補(bǔ)充。

3.2 構(gòu)建染色質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

與許多細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)一樣，染色質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)[31]具有無標(biāo)度和模塊化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，多數(shù)節(jié)點(diǎn)僅參與一個(gè)或兩個(gè)交互，而一些節(jié)點(diǎn)與不成比例的大量節(jié)點(diǎn)連接。染色質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)被組織成“社區(qū)”，社區(qū)內(nèi)的基因以協(xié)調(diào)方式執(zhí)行相關(guān)功能并對(duì)外部刺激做出反應(yīng)，意味著這些社區(qū)可能在數(shù)百萬年進(jìn)化過程中被塑造。

在未來的研究中，不僅可以將該方法應(yīng)用于其他特定類型的基因，還可以將相互依賴的網(wǎng)絡(luò)結(jié)合起來，因?yàn)榧?xì)胞活動(dòng)一起發(fā)生并且相互聯(lián)系。 此外，染色質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可能奠定3D或甚至4D基因組波的基礎(chǔ)，從靜態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)態(tài)[31]。

3.3 染色質(zhì)相互作用的功能研究

目前，已有多種方法用于研究Chia-Pet鑒定的染色質(zhì)相互作用的功能，即：熒光素酶報(bào)告基因測定[11]、目的蛋白的表達(dá)水平敲定實(shí)驗(yàn)[11]、來自轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的增強(qiáng)子測定法鑒定的調(diào)控元件[15]、基因組編輯方法（如鋅指核酸酶基因組編輯，TALENs和CRISPR / Cas9）干擾染色質(zhì)相互作用[16]。

3.4 染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的重建

染色質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)提供了更好的生物學(xué)功能景觀。到目前為止，遠(yuǎn)距離相互作用的數(shù)據(jù)適合于重建三維基因組結(jié)構(gòu)。2個(gè)3c衍生物，即hi-c[10]和Chia-Pet[9]，實(shí)際上反映了整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)。Hi-C技術(shù)可以捕獲所有的交互，但是分辨率很低。Chia-Pet技術(shù)大大提高了分辨率，但只能識(shí)別已知蛋白質(zhì)介導(dǎo)的相互作用。因此，Chia-Pet數(shù)據(jù)可用于進(jìn)行更為密集的建模。

對(duì)染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模主要有2種方法[32]。一種是物理模型，如用于解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的珠子串模型;另一種是用于重建結(jié)構(gòu)的非線性優(yōu)化模型。其中，物理模型方法中必須考慮許多物理性質(zhì)。重建結(jié)構(gòu)的非線性優(yōu)化模型的第一步是將染色質(zhì)相互作用頻率轉(zhuǎn)換為空間距離，基于此將空間距離轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)。由于缺乏直接參數(shù)來評(píng)估在全基因組范圍內(nèi)建立的三維結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡的發(fā)展將在促進(jìn)染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮重要作用。染色質(zhì)相互作用的可視化與功能測定結(jié)合是一種重要的方式，可以讓人們對(duì)基因組結(jié)構(gòu)有更直觀的印象，并全面了解基因組的功能。

4 結(jié)束語

本文介紹了Chia-Pet的實(shí)驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)分析過程，分析了幾種常用工具的特點(diǎn)和適用范圍，有助于研究中選用合適的方法以獲得更可靠的結(jié)果?，F(xiàn)已成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析的許多研究中，并已鑒定出不同的染色質(zhì)相互作用模型。盡管如此，在Chia-Pet協(xié)議和分析管道方面仍有亟待改進(jìn)之處，使協(xié)議更加簡潔和易于執(zhí)行，數(shù)據(jù)分析過程更加自動(dòng)化和可定制。

參考文獻(xiàn)

[1] REN B， ROBERT F， WYRICK J J， et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins[J]. Science， 2000， 290（5500）： 2306.

[2]WEI C L， WU Q， VEGA V B， et al. A global map of p53 transcription-factor binding sites in the human genome[J]. Cell， 2006， 124（1）： 207.

[3]JOHNSON D S， MORTAZAVI A， MYERS R M， et al. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions[J]. Science， 2007， 316（5830）： 1497.

[4]DEKKER J， RIPPE K， DEKKER M， et al. Capturing chromosome conformation[J]. science， 2002， 295（5558）： 1306.

[5]ZHAO Z， TAVOOSIDANA G， SJLINDER M， et al. Circular chromosome conformation capture （4C） uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra-and interchromosomal interactions[J]. Nature genetics， 2006， 38（11）： 1341.

[6]SIMONIS M， KLOUS P， SPLINTER E， et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip （4C）[J]. Nature genetics， 2006， 38（11）： 1348.

[7]DOSTIE J， RICHMOND T A， ARNAOUT R A， et al. Chromosome conformation capture carbon copy （5C）： A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements[J]. Genome research， 2006， 16（10）： 1299.

[8]de WIT E， De LAAT W. A decade of 3C technologies： Insights into nuclear organization[J]. Genes & development， 2012， 26（1）： 11.

[9]LIEBERMAN-AIDEN E， Van BERKUM N L， WILLIAMS L， et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome[J]. Science， 2009， 326（5950）： 289.

[10]LI G， RUAN X， AUERBACH R K， et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation[J]. Cell， 2012， 148（1-2）： 84.

[11]CHEPELEV I， WEI G， WANGSA D， et al. Characterization of genome-wide enhancer-promoter interactions reveals co-expression of interacting genes and modes of higher order chromatin organization[J]. Cell research， 2012， 22（3）： 490.

[12]HANDOKO L， XU H， LI G， et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells[J]. Nature genetics， 2011， 43（7）： 630.

[13]DOWEN J M， FAN Z P， HNISZ D， et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes[J]. Cell， 2014， 159（2）： 374.

[14]KIEFFER-KWON K R， TANG Z， MATHE E， et al. Interactome maps of mouse gene regulatory domains reveal basic principles of transcriptional regulation[J]. Cell， 2013， 155（7）： 1507.

[15]PAPANTONIS A， KOHRO T， BABOO S， et al. TNF[WT6BZ]α[WT6BZ]signals through specialized factories where responsive coding and miRNA genes are transcribed[J]. The EMBO Journal， 2012， 31（23）： 4404.

[16]DEMARE L E， LENG J， COTNEY J， et al. The genomic landscape of cohesin-associated chromatin interactions[J]. Genome research， 2013， 23（8）： 1224.

[17]LI G， FULLWOOD M J， XU H， et al. ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing[J]. Genome biology， 2010， 11（2）： R22.

[18]PAULSEN J， RDLAND E A， HOLDEN L， et al. A statistical model of ChIA-PET data for accurate detection of chromatin 3D interactions[J]. Nucleic acids research， 2014， 42（18）： e143.

[19]LI H， DURBIN R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform[J]. Bioinformatics， 2009， 25（14）： 1754.

[20]LANGMEAD B， TRAPNELL C， POP M， et al. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome[J]. Genome biology， 2009， 10（3）： R25.

[21]TENNAKOON C， PURBOJATI R W， SUNG W K. BatMis： A fast algorithm for k-mismatch mapping[J]. Bioinformatics， 2012， 28（16）： 2122.

[22]LI H， HANDSAKER B， WYSOKER A， et al. The sequence alignment/map format and SAMtools[J]. Bioinformatics， 2009， 25（16）： 2078.

[23]QUINLAN A R， HALL I M. BEDTools： A flexible suite of utilities for comparing genomic features[J]. Bioinformatics， 2010， 26（6）： 841.

[24]LANGER-SAFER P R， LEVINE M， WARD D C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America ， 1982，79：4381.

[25]PHANSTIEL D H， BOLE A P， HEI DARI N， et al. Mango： A bias-correcting Chia-Pet analysis pipeline[J]. Bioinformatics， 2015， 31（19）：3092.

[26]HE C， ZHANG M Q， WANG X. MICC： An R package for identifying chromatin interactions from ChIA-PET data[J]. Bioinformatics， 2015， 31（23）： 3832.

[27]FULLWOOD M J， LIU M H， PAN Y F， et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome[J]. Nature， 2009， 462（7269）： 58.

[28]HANDOKO L， XU H， LI G， et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells[J]. Nature genetics， 2011， 43（7）： 630.

[29]CHEPELEV I， WEI G， WANGSA D， et al. Characterization of genome-wide enhancer-promoter interactions reveals co-expression of interacting genes and modes of higher order chromatin organization[J]. Cell research， 2012， 22（3）： 490.

[30]HE C， WANG X， ZHANG M Q. Nucleosome eviction and multiple co-factor binding predict estrogen-receptor-alpha-associated long-range interactions[J]. Nucleic acids research， 2014， 42（11）： 6935.

[31]SANDHU K S， LI G， POH H M， et al. Large-scale functional organization of long-range chromatin interaction networks[J]. Cell reports， 2012， 2（5）： 1207.

[32]PENG C， LI G L， ZHANG H Y， et al. Reconstruction of three-dimensional structures of chromatin and its biological implications[J]. Scientia Sinica Vitae， 2014， 44（8）： 794.