一株纖維素降解菌的篩選、鑒定及對飼料粗纖維降解效果的研究

李鵬飛 廖 奇 陶 楊 魯瓊芬， 王后福 楊仁輝 冷 靜，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

纖維素作為光合作用的主要產(chǎn)物，是自然界中非常普遍和豐富的可再生自然資源[1]。纖維素約占地球總生物量的40%，其中89%左右的纖維素資源未能被開發(fā)利用，存在資源的大量擱淺及能源的浪費。通過化學(xué)、物理或者生物技術(shù)將纖維素分解成小分子物質(zhì)，被認(rèn)為是解決當(dāng)前食品短缺、能源危機(jī)、環(huán)境污染和生態(tài)平衡等問題的有效方法[2]。粗飼料中纖維素含量極高，超過其他碳水化合物含量的總和[3]。但動物消化道自身不含內(nèi)源纖維素酶，無法直接利用纖維素。研究發(fā)現(xiàn)食草反芻動物消化道內(nèi)共生的細(xì)菌、真菌等微生物能夠分泌纖維素酶，可幫助分解纖維素為動物提供能量[4]。纖維素酶能夠高效與纖維素分子結(jié)合，破壞纖維素分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，將纖維素分子分解成可被動物利用的小分子糖類物質(zhì)。并且在酶促反應(yīng)過程中，不會產(chǎn)生毒害物質(zhì)以及造成環(huán)境污染。微生物纖維素酶可能會是解決纖維素資源利用問題最環(huán)保的好辦法。將適量的纖維素酶制劑添加到畜禽飼料當(dāng)中，植物細(xì)胞壁被降解后，可使粗飼料中大量營養(yǎng)物質(zhì)得到充分釋放，能夠有效改善飼料營養(yǎng)價值，便于動物對其進(jìn)行消化和吸收。纖維素酶制劑對提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益、控制飼料成本等均具有積極作用[5]。國內(nèi)在篩選纖維素降解菌方面做了大量研究，但降解效率并不理想[6]。本文主要針對纖維素降解菌的篩選、分離、鑒定和對飼料纖維降解特性進(jìn)行研究。通過篩選出高活力的纖維素降解菌為纖維素酶制劑的開發(fā)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗羊場采集新鮮的成年綿羊（云南薩?？搜颉翞豕蔷d羊，♂，采食黑麥草青貯料、玉米秸稈青貯料、精料）糞便，于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要儀器

顯微鏡(奧林巴斯）；紫外可見光分光光度計（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）；恒溫培養(yǎng)箱（江蘇常州國華有限公司）；水浴恒溫?fù)u床（江蘇常州國華有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（江蘇常州國華有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國Sigma公司）；電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.1.3 主要試劑基因組提取試劑盒DNeasy Blood Tissue Kit，購自美國Qiagen公司；生化材料，購自大連寶生物公司；檸檬酸鐵、七水硫酸亞鐵、pNP、pNPG、水楊苷、3,5-二硝基水楊酸、七葉苷、異硫氰酸胍等，購自昆明謀好品科生物有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物等，購自云科生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的配制參考梁艷琳[7]和董恒[8]方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的富集與初篩

取新鮮的羊糞便樣品富集培養(yǎng)后，選取對羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基降解效果最好的菌株作為研究對象[9]。

1.2.2 纖維素降解菌的復(fù)篩

將經(jīng)過初篩后獲得的菌株接種于CMC-Na 液體復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、225 r∕min 搖床培養(yǎng)4 d，測定CMC 酶活力與FPA 酶活力，以酶活力為指標(biāo)篩選目的菌株。參照Senegani等[10]研究方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照Christakopoulos P[11]研究方法繪制pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線。

纖維素酶活力的測定：運用DNS 分光光度法測定纖維素酶活力，實驗原理及操作步驟參考有關(guān)資料[12-14]。β-葡萄糖苷酶活力可用比色法測定[11]，酶活力定義為1 ml 原酶液每分鐘催化底物產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位（U∕ml）。

1.2.3 菌株對飼料粗纖維的降解

分別加入3 g過200目篩的黑麥草、麩皮、玉米皮和米糠于4 個裝有100 ml 的LB 培養(yǎng)液的錐形瓶中，按照2%的比例接種培養(yǎng)液。每種底物設(shè)2個重復(fù)和一個未加菌液的空白對照，于37 ℃、220 r∕min分別培養(yǎng)36 h 后，取2 ml 發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r∕min 離心10 min制備粗酶液，并測其酶活力。然后將殘渣全部轉(zhuǎn)入已恒重的200 目的尼龍袋，參照胡艷平等[15]尼龍袋粗纖維測定方法檢測粗纖維的含量。

1.2.4 菌株種屬的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察其菌落與菌體形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

分子學(xué)鑒定：①基因組提取和16S rDNA基因擴(kuò)增基因組DNA提取參照李亞丹[16]、包蕾[17]和Yu等[18]的方法提取[16-18]。利用引物P1-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’和P1-R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’，對菌株進(jìn)行16S rDNA基因序列的擴(kuò)增[19]。電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符后，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。②16S rDNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。將菌株的16S rDNA序列在NCBI 中進(jìn)行Blast 序列比對與同源性分析，選出與該序列相似性較高的核酸序列用于系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。從而得到相關(guān)菌株16S rDNA 序列，用Mega 5.0軟件程序中的Neighbor-Joining法進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

從新鮮的羊糞便樣品中反復(fù)篩選分離得到36株菌落，其中25 株能夠在羧甲基纖維素鈉功能篩選培養(yǎng)基形成清晰的透明圈，根據(jù)菌株透明圈與菌株直徑比（H∕C）的大小，挑選H∕C 較大的10 株菌落，初步確定此菌株能夠產(chǎn)生纖維素酶，將這10 株菌落分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10；進(jìn)一步將所篩選到的10株菌株點種在底物為七葉苷的β-葡萄糖苷酶功能篩選培養(yǎng)基平板上，根據(jù)菌株黑色圈與菌株直徑比（D∕C），挑選D∕C 較大的6 株菌落，分別為B2、B3、B4、B5、B8、B10，初步確定此菌株能夠分泌β-葡萄糖苷酶。

根據(jù)羧甲基纖維素鈉功能篩選培養(yǎng)基H∕C 的大?。ū?），挑選出6 個黑色圈與菌株直徑比（D∕C）較大的菌株B2、B3、B4、B5、B8、B10 作為后續(xù)復(fù)篩的目的菌（表2），接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后，分別測定纖維素酶活力，依據(jù)復(fù)篩的結(jié)果，篩選出β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株B5 作為后續(xù)研究對象。

表1 不同細(xì)菌在CMC-Na和七葉苷鑒別培養(yǎng)基上的透明圈∕菌落直徑比值

表2 纖維素酶產(chǎn)生菌復(fù)篩結(jié)果(U∕ml)

2.2 B5菌株對粗纖維飼料降解

提取分別添加有黑麥草、麩皮、玉米皮和米糠發(fā)酵培養(yǎng)36 h后的粗酶液，按照DNS分光光度法測定纖維素酶活力以及飼料粗纖維降解率。結(jié)果顯示，在添加麩皮和黑麥草的培養(yǎng)基中纖維素酶活力較高，分別為1 466 U∕ml 和1 293 U∕ml，對粗纖維降解率分別為34.13%和29.06%，在添加米糠和玉米皮的培養(yǎng)基中纖維素酶活力較低，分別為323 U∕ml 和450 U∕ml，粗纖維降解率為5.78%和7.64%（表3）。相關(guān)性分析顯示，飼料粗纖維的含量與粗纖維降解率、酶活力的相關(guān)系數(shù)分別為0.53和0.546，雙側(cè)顯著性概率值分別為0.47和0.454，在相關(guān)系數(shù)0.01的水平上沒有顯著的相關(guān)性，酶活力與粗纖維降解率的相關(guān)系數(shù)為0.999，雙側(cè)顯著性概率為0.001，雙星號標(biāo)記表明0.999的相關(guān)系數(shù)在0.01的水平上達(dá)到極顯著，說明二者相關(guān)性很強(qiáng)，并且呈正相關(guān)（表4），驗證了圖1直觀結(jié)果。

表3 菌株產(chǎn)酶及對飼料粗纖維降解率的影響

表4 飼料粗纖維含量、粗纖維降解率和酶活力相互之間的影響

圖1 菌株產(chǎn)酶及對飼料粗纖維降解率的影響

2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

菌株B5 在LB 平板上37 ℃培養(yǎng)12 h 后，革蘭氏染色呈藍(lán)色，為革蘭氏陽性菌，氣生菌絲與營養(yǎng)菌絲分明，并且可以觀察到個別孢子（圖2a），其菌落為不規(guī)則圓形，菌落中央微凸、菌落有絲狀的紋理、正面白色、干燥、不透明、難以挑?。▓D2b）。隨著培養(yǎng)時間的延長，形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，反面呈現(xiàn)暗灰色（圖2c、2d），初步鑒定為放線菌。

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

2.4 B5菌株基因組DNA提取

提取菌株B5 基因組DNA，電泳檢測結(jié)果大于20 000 bp，基因組DNA片段為一條單帶，不含有RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)量較好，可以滿足PCR 對擴(kuò)增模板的要求（圖3）。

圖3 菌株基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 B5菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增

以B5菌株基因組DNA為模板，P1-F∕P1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物為一條單帶，大約1 500 bp，與預(yù)期相符（圖4）。

圖4 16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.6 B5菌株16S rDNA序列測定與分析

序列測序結(jié)果如圖5，B5 菌株16S rDNA 序列全長1 585 bp。

圖5 菌株B5的16S rDNA序列

將B5菌株序列提交NCBI進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示B5 菌株與鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）同源性達(dá)99%（表5）。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用Clustal X2.0 進(jìn)行序列比對，在進(jìn)化關(guān)系上B5菌株與鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）聚成一簇，同源性高達(dá)99%，初步鑒定B5 菌株屬于放線菌中的鏈霉菌屬成員（圖6）。

3 討論

3.1 產(chǎn)纖維素酶降解菌的篩選與鑒定

眾所周知，在反芻動物瘤胃內(nèi)棲息著數(shù)量龐大且種類復(fù)雜的微生物菌群，其參與瘤胃纖維的降解，使得反芻動物能夠以富含纖維素的牧草為食。因此，反芻動物體內(nèi)排出的糞便內(nèi)存在某些高效纖維素降解菌。張慶芳等[21]從西藏黃牛瘤胃液中篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，被鑒定為燦爛類芽孢桿菌。朱立濤等[22]研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物依靠瘤胃微生物對粗纖維的消化率高達(dá)60%。然而未能在消化道內(nèi)利用的粗纖維會以糞便的形式排出體外，這些難以利用的粗纖維最終會被微生物降解。趙方圓等[23]從羊的糞便中分離出了一株纖維素降解菌，經(jīng)鑒定為Aspergillus sp. YN1。馬雪姣等[24]通過剛果紅功能篩選法從牛的糞便中篩選到了3株能夠高效降解纖維素的細(xì)菌，繼代培養(yǎng)后分離到一株能夠穩(wěn)定遺傳的菌株。在本研究中，利用剛果紅功能篩選法從綿羊糞便中篩選到B5菌株。B5菌株分泌的纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活力最大，分別為720 U∕ml與670 U∕ml，H∕C與D∕C分別為4.9與2.8。結(jié)果表明，初篩所產(chǎn)生的透明圈與菌落的直徑比（H∕C，D∕C）成正相關(guān)，與姜立春等[6]、胡艷平等[15]、包衍等[25]研究結(jié)果一致。形態(tài)學(xué)分析表明，B5 菌株的菌落為不規(guī)則圓形，正面白色、干燥、不透明、難以挑取，中央微凸，菌落有絲狀的紋理，氣生菌絲與營養(yǎng)菌絲分明，革蘭氏陽性菌，因此，初步鑒定可能為放線菌。

在本研究中，B5 菌株16S rDNA 基因序列全長1 585 bp，與鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）同源性高達(dá)99%，初步鑒定B5 菌株屬于放線菌中的鏈霉菌屬。鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）作為自然環(huán)境中最豐富的放線菌，能夠產(chǎn)生多種纖維素分解酶，是參與纖維素降解的重要菌屬[26]。

3.2 菌株B5對不同飼料粗纖維降解率及酶活力分析

飼料的種類以及飼料中纖維素的種類可能是導(dǎo)致粗纖維降解率差異的原因。本實驗研究了向LB培養(yǎng)基中添加黑麥草、麩皮、玉米皮和米糠對B5發(fā)酵產(chǎn)酶以及對粗纖維降解率的影響。在相同的發(fā)酵條件下，添加黑麥草和麩皮的培養(yǎng)基中粗纖維的降解率（29.06%和34.13%）明顯高于玉米皮和米糠（7.64%和5.78%）。加入B5菌株的黑麥草與麩皮所得到的纖維素降解率與宋波等[27]、劉旭[28]的研究相似，他們在草食動物糞便與奶牛糞便中篩選到能夠分泌高活性纖維素酶的鏈霉菌，對牛糞便和秸稈的粗纖維降解率分別為17.8%和31.4%。酶活力分析表明，粗纖維的降解率與酶活力呈正相關(guān)，在添加黑麥草和麩皮的情況下酶活力分別為1 293 U∕ml 和1 466 U∕ml，遠(yuǎn)高于玉米皮（450 U∕ml）和米糠（323 U∕ml）。與胡艷平等[15]研究相同，其使用菌株HY3 發(fā)酵處理麩皮、麥草秸稈和燕麥秸稈，60 h后麩皮的纖維素降解率為7.41%，顯著高于麥草秸稈和燕麥秸稈。但是在相同的發(fā)酵時間下，本實驗麩皮的纖維素降解率為34.13%，顯著高于胡艷平的結(jié)果。Xiao等[29]研究發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化Neurospo

ra.crassa（粗壯脈紋胞菌）對茶粕的發(fā)酵條件，在74.9 h后，其粗纖維降解率高達(dá)48.65%。文少白等[30]利用無花果曲霉和康寧木霉對香蕉莖稈發(fā)酵處理發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的纖維素酶活力分別為699.8 U∕ml和332.02 U∕ml，粗纖維降解率分別為22.39%和20.89%。在本研究中，黑麥草的纖維素含量最高（42.50%），遠(yuǎn)高于麩皮（10.40%）、玉米皮（7.20%）和米糠（7.27%），其粗纖維降解率與麩皮接近，遠(yuǎn)高于玉米皮與米糠。以上研究表明，B5 菌株對飼料粗纖維降解效率與酶活力顯著相關(guān)，與飼料中纖維素含量相關(guān)性不明顯。

表5 B5菌株16S rDNA同源性比對

圖6 B5系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論

從綿羊糞便中篩選到25 株纖維素降解菌，并對其中產(chǎn)酶活力最高的一株細(xì)菌B5 進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示B5菌株屬于放線菌中的鏈霉菌屬。B5菌株對飼料粗纖維的降解效率與其酶活力顯著相關(guān)，與飼料中纖維素含量相關(guān)性不明顯。