超聲協(xié)同吡羅昔康對牛血清白蛋白的損傷研究

劉 彬，董浩博，王冬晶，姚路揚(yáng)，翁玉欣，付林玉，楊微微，徐 淼

(1.遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.北京利齡恒泰藥業(yè)有限公司，北京 102205)

0 引言

腫瘤是威脅人類健康最兇險的疾病之一.目前，對于腫瘤的治療手段主要是抗腫瘤藥物的聯(lián)合化療、放療和手術(shù)治療等，但是這些治療手段都或多或少存在著一定的缺陷，對于正常細(xì)胞的損傷是人們不能無視的副作用[1].所以，尋找選擇性更好，副作用更小的治療腫瘤的新方法，始終是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn).

自1975年，Kelly和Snell應(yīng)用光動力療法首次治療膀胱癌的研究報道之后[2]，光動力學(xué)療法在眾多腫瘤的治療過程中相繼開展.由于光在人體組織中的穿透性不好，使得光動力治療腫瘤主要集中在人體的表面，無法對于深層的腫瘤起到有效的作用[3，4]，為了克服光動力療法治療腫瘤的局限性，利用超聲抗腫瘤已成為研究熱點(diǎn)之一.超聲波具有穿透性強(qiáng)、無創(chuàng)傷性且操作簡便等特點(diǎn)，作為激發(fā)源有望克服光動力治療存在的諸多局限性.因此，一種利用超聲激活癌細(xì)胞內(nèi)富集的聲敏劑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不可逆性損傷的新型治療癌癥的聲動力學(xué)療法近年來引起眾多研究人員的關(guān)注[5，6].然而，目前相關(guān)報道多以腫瘤細(xì)胞為研究對象，通過損傷細(xì)胞膜使腫瘤細(xì)胞壞死來達(dá)到治療腫瘤的目的[7].由于正常組織細(xì)胞膜和癌癥細(xì)胞膜之間的差別較小，因此，抑制和殺死腫瘤細(xì)胞應(yīng)以供給具有各種功能而且容易使藥物具有靶向性的生物大分子為目標(biāo)[8，9].眾所周知，蛋白質(zhì)具有多種生理功能，如果被損傷，則無法完成重要功能，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的.白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，而牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)有70%以上的同源性，因此BSA常代替HSA被選作模型蛋白[10].

圖1 吡羅昔康結(jié)構(gòu)示意圖

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，替諾昔康具有一定的聲敏性，為了開發(fā)更多聲敏劑，本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察了另一種非甾體抗炎藥吡羅昔康(PIR，結(jié)構(gòu)式見圖1)的聲敏性.考察了藥物濃度和超聲時間對PIR協(xié)同超聲損傷BSA的影響，并探討了作用機(jī)制，該項研究為推動分子水平的聲動力療法研究提供了有意義的參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

KQ5200DB型數(shù)控超聲反應(yīng)器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2100型雙光束紫外/可見分光光度計(北京瑞麗分析儀器公司)；F-7000型熒光光度計(日本日立公司)；PIR(蘭明科技有限公司)；BSA(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；二苯卡巴肼(DPCI)、疊氮化鈉(NaN3)、抗壞血酸(Vc)、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)及L-組氨酸(L-His)均購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純，實驗用水為雙蒸水.

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲結(jié)合PIR對BSA的損傷研究

取6個25 mL容量瓶標(biāo)記為a～f，分別向其中加入10 mL濃度為2.5×10-5mol/L的BSA溶液，向b～f中加入不同體積濃度為1.0×10-4mol/L的PIR儲備液，用NaCl-Tris-HCl緩沖液稀釋至刻度，使PIR的濃度分別為0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5×10-5mol/L.將上述溶液平均分成兩份置于50 mL錐形瓶中，一份在放入頻率為400 kHz的超聲裝置中，調(diào)節(jié)溫度為37 ℃，功率為50 W，超聲照射，另一份暗處放置.3 h后取樣，分別測定熒光光譜，激發(fā)波長280 nm，狹縫均為5 nm，掃描的波段范圍200～800 nm.此外，取5個25 mL容量瓶，同前文所述，使溶液中BSA濃度為1.0×10-5mol/L，PIR濃度為0.6×10-5mol/L，考察時間因素對BSA損傷作用的影響.

1.2.2 BSA損傷機(jī)制研究

取6個10 mL容量瓶標(biāo)記為a～f，向其中分別加入2 mL濃度為2.5×10-2mol/L的DPCI溶液，b～f中加入不同體積濃度為1.0×10-4mol/L的PIR儲備液，用NaCl-Tris-HCl緩沖液稀釋至刻度，使PIR的濃度分別為0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5×10-5mol/L.轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶中調(diào)節(jié)溫度為37 ℃，功率為50 W，超聲照射.1.0 h后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中用苯-四氯化碳萃取劑萃取，定容至10 mL.用萃取劑作參比，在563 nm處測吸光度A樣，暗處放置樣品吸光度A對照作空白，以ΔA=(A樣-A對照)表示活性氧相對產(chǎn)生量.然后，參照上述操作，固定溶液中PIR濃度為0.6×10-5mol/L，分別考察超聲時間為0，15，30，45，60，75 min及猝滅劑(NaN3、Vc、L-His、BHT)因素對活性氧產(chǎn)量及種類的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲結(jié)合PIR對BSA的損傷

2.1.1 PIR濃度對超聲協(xié)同PIR損傷BSA的影響

圖2 PIR濃度改變對超聲協(xié)同PIR損傷BSA的影響

從圖2可以看出，隨著PIR濃度的增加，無論有無超聲照射，BSA在340 nm處的熒光均被猝滅，說明PIR損傷BSA具有濃度依賴性.并且，經(jīng)超聲協(xié)同PIR作用后，任一濃度條件下BSA的猝滅程度均大于無超聲照射組，證明超聲加劇了PIR對BSA的損傷作用.但是，其加劇程度并不與PIR濃度的增大而增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.9×10-5mol/L后對BSA的損傷程度不再進(jìn)一步增大.有文獻(xiàn)報道，BSA內(nèi)源熒光來自于分子中色氨酸殘基和酪氨酸殘基[12]，因此可推斷上述現(xiàn)象的出現(xiàn)應(yīng)該與氨基酸殘基逐漸被破壞，不再具有熒光性有關(guān).

2.1.2 照射時間對PIR聯(lián)合超聲損傷BSA的影響

圖3 時間因素對超聲協(xié)同PIR損傷BSA的影響

從圖3中可以看出，無論有無PIR存在，隨著超聲照射時間的延長，BSA熒光強(qiáng)度均呈下降趨勢，說明超聲照射時間的延長加劇了BSA分子中可產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基破壞程度，使其不再具有熒光性，從而導(dǎo)致BSA熒光強(qiáng)度隨之降低.特別是當(dāng)超聲與PIR協(xié)調(diào)作用后，BSA的熒光發(fā)生更加明顯的淬滅現(xiàn)象.這說明隨著超聲時間延長，更多PIR被激活，進(jìn)而導(dǎo)致更多的產(chǎn)熒光氨基酸殘基被破壞.此外，從圖中亦可看出，在超聲初期BSA損傷最為明顯，隨著超聲時間進(jìn)一步延長，盡管BSA被進(jìn)一步損傷，但程度趨于平緩.

2.2 活性氧的鑒定

本實驗利用二苯卡巴肼(DPCI)可捕獲光敏劑產(chǎn)生的活性氧，生成二苯卡巴腙(DPCO)，用有機(jī)溶劑萃取后DPCO在563 nm處有強(qiáng)吸收的機(jī)理檢測體系中活性氧產(chǎn)量[13].

2.2.1 PIR濃度對活性氧生成的影響

圖4 PIR濃度對活性氧產(chǎn)量的影響

圖4為不同濃度PIR在超聲照射1h后，萃取液中DPCO的吸光度情況.由圖中可見，當(dāng)PIR濃度在0.9×10-5mol/L以下時，活性氧的產(chǎn)量隨著PIR濃度增大而增加；當(dāng)濃度超過0.9×10-5mol/L時，活性氧的產(chǎn)量則隨著濃度的增大而下降.這一現(xiàn)象可能是因為當(dāng)藥物濃度過大時，減弱了光的傳播，影響聲致發(fā)光作用效果，導(dǎo)致PIR不能有效利用聲能，從而使活性氧的產(chǎn)量下降，該結(jié)果與前文PIR濃度因素對BSA損傷效果相一致.

2.2.2 超聲照射時間對活性氧產(chǎn)量的影響

圖5 超聲照射時間對活性氧產(chǎn)量的影響

從圖5可知，無超聲條件下，加藥組與空白組均有少量的活性氧存在，但其產(chǎn)量并不隨放置時間延長而改變.當(dāng)對PIR+BSA混合體系進(jìn)行超聲照射后，體系中活性氧產(chǎn)量隨時間的延長明顯增大，并且照射時間大于30 min后，其增加幅度遠(yuǎn)大于空白組，說明PIR不僅具有良好的聲敏性，且與照射時間有依附性.

2.2.3 活性氧種類的鑒定

圖6 不同活性氧猝滅劑對體系中活性氧產(chǎn)量的影響

圖6反映了加入不同活性氧猝滅劑Vc、BHT、L-His和NaN3后，體系中活性氧產(chǎn)量的變化.由圖可知，NaN3(單線態(tài)氧猝滅劑)對超聲體系中活性氧的猝滅效果不是很明顯，說明該體系中單線態(tài)氧的產(chǎn)量相對較低；然而，BHT、Vc(自由基猝滅劑)和L-His(單線態(tài)氧和羥基自由基猝滅劑)對體系中活性氧展示出明顯的猝滅作用.由上述結(jié)果初步推斷，超聲可激活PIR產(chǎn)生活性氧物質(zhì).并且以自由基為主，同時產(chǎn)生少量單線態(tài)氧.此外，由于Vc的加入并沒有使體系中所有活性氧物質(zhì)發(fā)生猝滅，說明還存在其它種類活性氧物質(zhì).

3 結(jié)論

本實驗利用熒光光譜和紫外可見光譜研究了超聲協(xié)同PIR對BSA的損傷作用及其機(jī)理，并進(jìn)一步考察了超聲照射時間、藥物濃度對其損傷作用的影響.研究結(jié)果表明，超聲協(xié)同PIR可對BSA造成明顯的損傷，且損傷程度隨著PIR濃度和超聲照射時間的增大而增強(qiáng).超聲可激活PIR產(chǎn)生單線態(tài)氧、羥基自由基、過氧化物等一系列活性氧成分，其中自由基占大多數(shù)、少部分為單線態(tài)氧、過氧化物等，且產(chǎn)生活性氧的能力隨時間延長而增加，與藥品濃度有一定的關(guān)系.該研究對聲敏劑的開發(fā)及超聲協(xié)同聲敏劑在抗腫瘤、抗菌治療中創(chuàng)新性應(yīng)用具有重要意義.