潰瘍性結(jié)腸炎患者中誘騙受體和護(hù)骨素基因多態(tài)性及其結(jié)腸組織表達(dá)水平分析

邵曉曉 金穎莉 林芊如 閔全佳 朱浩奇 蔣 益

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥，主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層，范圍多自遠(yuǎn)端結(jié)腸開(kāi)始，可逆行向近端發(fā)展，甚至累及全結(jié)腸及末端回腸，病灶多呈連續(xù)性分布。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，UC的全球發(fā)生率不斷升高，我國(guó)亦是逐年增加[1]。UC的確切病因和發(fā)生機(jī)制至今尚未闡明，而且由于缺少特異性的治療手段和藥物，UC患者的病情常遷延、反復(fù)，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是調(diào)控機(jī)體正常發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生理過(guò)程，研究證實(shí)細(xì)胞凋亡失調(diào)在UC的發(fā)病中占有十分重要的地位，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡過(guò)度，黏膜固有層淋巴細(xì)胞(LPT)凋亡抵抗和凋亡遲滯，是導(dǎo)致腸組織炎性反應(yīng)發(fā)生和持續(xù)的重要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)在UC炎癥局部及其鄰近區(qū)域，整個(gè)結(jié)腸隱窩上皮細(xì)胞均有凋亡現(xiàn)象。用多種凋亡標(biāo)志物檢測(cè)UC和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的程度和范圍，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性UC病變區(qū)域上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生的程度和范圍都高于正常組織[3]。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis- inducing ligand, TRAIL) 能激活外源性凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)TRAIL與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis, AIT)等疾病相關(guān)[4～7]。TRAIL主要通過(guò)與死亡受體(death receptor, DR)4或DR5結(jié)合，產(chǎn)生促細(xì)胞凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。除DR4、DR5外，TRAIL受體家族還包括誘騙受體(decoy receptor, DcR)1、DcR2及護(hù)骨素(osteoprotegerin, OPG)。TRAIL與死亡受體結(jié)合，通過(guò)天冬氨酸蛋白水解酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8, caspase-8)和Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain, FADD)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)，但DcR1缺乏跨膜區(qū)及胞內(nèi)域，DcR2僅含有截?cái)嗟乃劳鼋Y(jié)構(gòu)域，OPG缺乏功能性的死亡結(jié)構(gòu)域，因此這3種受體與TRAIL結(jié)合后不僅不產(chǎn)生細(xì)胞凋亡信號(hào)，還與DR4或DR5競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TRAIL，抑制靶細(xì)胞凋亡。

本研究組前期初步探討了TRAIL基因3′非翻譯端 (G1525A、G1588A、C1595T)3個(gè)SNPs和血漿sTRAIL水平以及死亡受體DR4、DR5基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群UC易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UC患者中TRAIL(G1525A、G1588A、C1595T)位點(diǎn)的突變率明顯高于對(duì)照組，提示這3個(gè)SNP的突變對(duì)UC具有保護(hù)作用，可能是影響UC易感性的潛在功能性位點(diǎn)[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DcR2(rs1133782位點(diǎn))基因多態(tài)性可能影響UC的易感性，OPG(rs3102735)基因突變不僅會(huì)增加UC的患病風(fēng)險(xiǎn)，還可能影響UC的疾病嚴(yán)重程度[9]。但由于TRAIL的生物學(xué)效應(yīng)受多種因素的影響，尤其是與TRAIL受體家族的表達(dá)或功能密不可分，因此本研究將進(jìn)一步探討結(jié)腸組織中DcR1、DcR2和OPG的表達(dá)水平與UC的關(guān)系，旨在為揭示UC的遺傳免疫學(xué)機(jī)制提供線索。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:收集2018年3月～2019年4月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化住院和門診確診的UC患者56例，其中男性26例，女性30例，患者平均年齡38.42±15.24歲。同期于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科收集的性別、年齡相匹配的良性結(jié)腸息肉患者62例(男性30例，女性32例)，患者平均年齡37.56±16.36歲。依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病分會(huì)制定的“炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)”[10]，經(jīng)臨床、實(shí)驗(yàn)室、胃鏡、結(jié)腸鏡、小腸鏡或膠囊內(nèi)鏡、放射影像學(xué)及病理組織學(xué)等檢查綜合確立UC診斷，所有納入研究的病例均為初發(fā)型UC。依據(jù)結(jié)腸鏡表現(xiàn)將UC疾病部位分為遠(yuǎn)端結(jié)腸炎 (E1+E2，31例) 和廣泛結(jié)腸炎 (E3，25例)。依據(jù)“改良的Truelove & Witts評(píng)分”將UC疾病嚴(yán)重程度分為輕度(23例)、中度(28例)和重度(5例)[11]。所有UC病例納入前經(jīng)各項(xiàng)檢查排除感染性腹瀉、缺血性腸病、放射性腸炎、消化道腫瘤、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎等疾病。以上研究對(duì)象均來(lái)自無(wú)血緣關(guān)系的浙江漢族人群，所有入選者均簽署知情同意書(shū)，本研究獲得溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.RT-qPCR檢測(cè)結(jié)腸組織中DcR1、DcR2和OPG的表達(dá)水平：(1) 標(biāo)本采集：56例UC患者和62例性別、年齡相匹配的良性結(jié)腸息肉患者均采用結(jié)腸鏡活檢鉗留取乙狀結(jié)腸部位 (距肛緣30cm) 的黏膜組織，大小約2mm×2mm×2塊，一部分置于-80℃凍存?zhèn)溆?，另一部分?%多聚甲醛固定保存，石蠟包埋后以4～5μm厚度連續(xù)病理切片。(2) RT-qPCR檢測(cè)：采用TRIzol試劑 (美國(guó)Invitrogen公司)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，在嚴(yán)格無(wú)菌條件下提取結(jié)腸組織總RNA。NanoDrop-2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)RNA純度和濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國(guó)Applied Biosystems公司) 合成cDNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如下：β-actin上游引物：5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游引物：5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′；DcR1上游引物：5′-GTGGTTCGTTTTGATTTGCCC-3′，下游引物：5′-CGTGTTGATTGTGACTCGTGGA-3′；DcR2上游引物：5′-AACATGGTCCTGCTTGTGACG-3′，下游引物：5′-ATCTGCGGTCTCACTGGTCTG-3′；OPG上游引物：5′-CCTGGATTTGGAGTGGTGCAA-3′，下游引物：5′-AATGCCTCCTCACACAGGGTA-3′；以cDNA為模板，嚴(yán)格按照RT-qPCR試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，25μl反應(yīng)體系中含cDNA 2.5μl，上下游引物各1.0μl，2×real time RT-PCR Mix 12.5μl和適量去離子水。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸組織中DcR1、DcR2和OPG蛋白表達(dá)水平：主要試劑包括鼠抗人DcR1、DcR2、OPG抗體 (英國(guó)Abcam公司)，抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒 (丹麥Dako Denmark A/S公司)。石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h，然后二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇水化，切片PBS浸泡后，用PBS沖洗3次，每次5min。切片置于pH 6.0檸檬酸緩沖液中微波修復(fù)，微波爐中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸。自然冷卻后用PBS洗3次，每次5min。切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS洗3次，每次5min，甩干后用5%牛血清白蛋白 (BSA) (瑞士羅氏公司) 室溫20min封閉非特異性反應(yīng)位點(diǎn)。每張切片加入50μl 200倍稀釋的鼠抗人DcR1、DcR2、OPG抗體 (英國(guó)Abcam公司) 覆蓋組織，4℃過(guò)夜。PBS洗3次，每次5min。去除PBS液，每張切片加50～100μl的抗兔/鼠通用型免疫組化二抗 (丹麥Dako Denmark A/S公司)，4℃孵育50min。PBS洗3次，每次5min。去除PBS，每張切片加50～100μl新鮮配制二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 溶液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間。顯色完全后，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化 (1s)，蒸餾水沖洗，1%氨水(NH3·H2O) 返藍(lán)，自來(lái)水沖洗。最后切片經(jīng)過(guò)梯度乙醇(70%～90%～95%～100%)各10min，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察。免疫組化結(jié)果判定以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性。在200倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件 (美國(guó)Media Cybernetics公司) 分析每張圖片中陽(yáng)性染色部分的平均光密度 (IOD/Area) 值，取均值表示DcR1、DcR2、OPG蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.DcR1、DcR2、OPG基因多態(tài)性與UC易感性的關(guān)系:UC組和對(duì)照組中，DcR1 (rs12549481)、DcR2 (rs1133782)和OPG (rs3102735) 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(UC組：P=0.543，0.763，0.845；對(duì)照組：P=0.666，0.587，0.582)。非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，UC組中DcR2 (rs1133782)的突變等位基因(A)和基因型(GA+AA)頻率均顯著增高(15.18% vs 6.45%，OR=2.595，95%CI：1.073～6.274，P=0.030；28.57% vs 12.90%，OR=2.700，95%CI：1.053～6.926，P=0.035，表1)。而其他兩個(gè)SNP的突變等位基因和基因型頻率在UC組和對(duì)照組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.UC組和對(duì)照組的結(jié)腸組織中DcR1、DcR2、OPG mRNA表達(dá)水平比較:UC患者結(jié)腸組織中DcR2 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(4.49±2.29 vs 9.49±4.06，t=8.134，P<0.01)。56例UC患者中，攜帶DcR2(rs1133782)(GG)基因型40例，(GA)基因型15例，(AA)基因型1例。與攜帶DcR2(rs1133782)基因型 (GG) 的UC患者比較，攜帶DcR2 (rs1133782)(GA+AA)基因型的患者結(jié)腸組織中DcR2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(3.64±1.63 vs 6.62±2.35，t=5.43，P<0.01)。而UC組中，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735)不同基因型攜帶者之間DcR1、OPG mRNA表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3.UC組和對(duì)照組的結(jié)腸組織中DcR1、DcR2、OPG蛋白表達(dá)水平比較：UC組結(jié)腸組織中DcR2蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(0.180±0.052 vs 0.273±0.069，t=8.322，P<0.01，圖1)。UC患者中，與攜帶DcR2 (rs1133782)(GG)基因型的患者比較，攜帶DcR2 (rs1133782)(GA+AA)基因型的患者結(jié)腸組織中DcR2蛋白表達(dá)水平也顯著降低(0.129±0.028 vs 0.198±0.047，t=7.147，P<0.01，圖2)。而UC組中，DcR1和OPG的不同基因型攜帶者之間蛋白表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎(UC)組和對(duì)照組DcR1、DcR2、OPG基因多態(tài)性分布差異[n(%)]

圖1 兩組結(jié)腸組織中DcR2蛋白的染色結(jié)果(HE,×400)A.對(duì)照組;B.UC患者

圖2 UC患者結(jié)腸組織中DcR2蛋白的染色結(jié)果(HE,×400)A.基因型GG;B.基因型GA+AA

討 論

人類DcR1、DcR2基因均定位于8號(hào)染色體短臂2區(qū)1～2帶。DcR1 (rs12549481)位于啟動(dòng)子上游第376個(gè)堿基位點(diǎn)，當(dāng)該位點(diǎn)野生型等位基因(T)突變?yōu)?C)后可能在轉(zhuǎn)錄水平影響DcR1蛋白表達(dá)水平[11,12]。DcR2 (rs1133782)位于第7外顯子，此SNP的等位基因(G)突變?yōu)?A)時(shí)，可以使正常的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，從而導(dǎo)致DcR2蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和生理功能發(fā)生異常[13]。OPG基因位于染色體8號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)4帶，OPG (rs3102735)位于啟動(dòng)子上游第759個(gè)堿基位點(diǎn)，此等位基因(C)突變?yōu)?T)時(shí)可能影響OPG的蛋白質(zhì)表達(dá)水平[14]。理論上，TRAIL凋亡信號(hào)主要受TRAIL及其受體的影響。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，DcR2 (rs1133782)基因多態(tài)性可能影響UC的易感性，OPG (rs3102735)基因突變不僅會(huì)增加UC的患病風(fēng)險(xiǎn)，還可能影響UC的疾病嚴(yán)重程度。本研究也證實(shí)DcR2(rs1133782)突變可能增加UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但因?yàn)闃颖玖克?，故未進(jìn)行進(jìn)一步分層分析。近年來(lái)，DcR1、DcR2和OPG基因多態(tài)性及其表達(dá)水平與多種腫瘤及自身免疫性疾病的相關(guān)性研究備受研究者的關(guān)注。Riccioni等[11]發(fā)現(xiàn)急性髓性白血病中DcR1、DcR2的表達(dá)水平增高，并與該病病程顯著相關(guān)。有研究報(bào)道，DcR1 (rs12549481)基因多態(tài)性與韓國(guó)人群早期非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病無(wú)顯著相關(guān)性[15]。另有研究顯示，DcR1 (rs12549481)基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群 T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)亦無(wú)顯著關(guān)聯(lián)[16]。Ulybina等[17]研究報(bào)道，DcR2 (rs1133782)基因多態(tài)性與俄羅斯人群肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。還有研究顯示DcR2 (rs1133782)基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群的T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著相關(guān)性[16]。此外，有研究者對(duì)法國(guó)前列癌患者的研究顯示DcR2水平下調(diào)能提高前列腺癌中LNCaP細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感度，提示DcR2可能與前列腺癌的發(fā)病有關(guān)[12]。

Büneker等[13]研究認(rèn)為DR4/(DcR1+DcR2)之比可作為預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞是否對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)敏感的指標(biāo)。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)DcR2是p53的靶基因之一，受內(nèi)源性p53結(jié)合位點(diǎn)的調(diào)控，并且DcR2還能調(diào)節(jié)患者對(duì)化療藥物的敏感度。另有研究報(bào)道DcR1、DcR2對(duì)死亡受體的影響存在差異，DcR2優(yōu)先抑制DR5誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，提示在誘騙受體中，DcR2可能較DcR1的作用更為重要[18]。Christoph等[19]研究發(fā)現(xiàn)，OPG mRNA表達(dá)水平與前列腺癌患者癌細(xì)胞擴(kuò)散相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞表面DcR1和DcR2的表達(dá)水平與RA的嚴(yán)重程度相關(guān)。Ney等[20]在高加索人群中發(fā)現(xiàn)攜帶OPG (rs3102735)等位基因(C)發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性將增加1.5倍。對(duì)自身免疫性甲亢的研究顯示，OPG (rs3102735)基因多態(tài)性與患者的骨密度相關(guān)，該位點(diǎn)等位基因(C)的攜帶者，其遠(yuǎn)端脛骨發(fā)生骨密度降低的風(fēng)險(xiǎn)性可能增加。Assmann等[21]研究報(bào)道OPG(rs3102735)基因多態(tài)性與德國(guó)人群RA的易感性無(wú)關(guān)。另有研究顯示,OPG(rs3102735)基因多態(tài)性可能不影響銀屑病的易感性。

本研究采用RT-qPCR和免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中DcR1、DcR2、OPG mRNA和蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與良性結(jié)腸息肉對(duì)照組比較，UC患者結(jié)腸組織中DcR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。本研究還在攜帶不同基因型的UC患者之間，進(jìn)一步分析比較結(jié)腸組織中DcR1、DcR2、OPG mRNA和蛋白表達(dá)水平是否存在差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與攜帶DcR2(rs1133782) (GG)基因型的UC患者比較，攜帶(GA+AA)基因型的UC患者結(jié)腸組織中DcR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，但對(duì)照組和UC患者之間以及攜帶不同基因型的UC患者之間DcR1、OPG mRNA及蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述研究結(jié)果提示，DcR2 (rs1133782)基因突變可能降低UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，機(jī)制可能通過(guò)降低DcR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平發(fā)揮作用，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735) 基因多態(tài)性及其腸組織表達(dá)水平與UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。而DcR1和DcR2抑制TRAIL凋亡機(jī)制的差異充分表明TRAIL凋亡信號(hào)的調(diào)節(jié)機(jī)制及影響因素相當(dāng)復(fù)雜。綜合上述研究結(jié)果，筆者推測(cè)在UC病程中DcR2對(duì)TRAIL凋亡信號(hào)的抑制作用可能比DcR1更為重要，DcR2 (rs1133782)可能是影響UC易感性的潛在功能性位點(diǎn)，突變后可能造成DcR2蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常，使DcR2對(duì)TRAIL凋亡信號(hào)的抑制效應(yīng)降低，進(jìn)而影響UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。OPG屬分泌型糖蛋白，是一種可溶性游離受體，在體內(nèi)主要發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞發(fā)生和增加骨密度的作用。在正常生理狀態(tài)下，與TRAIL的其他受體比較，OPG與TRAIL的親和力最弱，所誘導(dǎo)的凋亡抑制作用也顯著弱于DcR1和DcR2[22]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DcR2 (rs1133782)基因突變可能降低UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，機(jī)制可能通過(guò)降低DcR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平發(fā)揮作用，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735) 基因多態(tài)性及其結(jié)腸組織表達(dá)水平與UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。但由于TRAIL誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制紛繁復(fù)雜，本研究尚無(wú)法闡明DcR2 (rs1133782)影響UC發(fā)病的具體機(jī)制，有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探討和論證。