miR-630對H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、凋亡與氧化損傷的影響

周 洋 陳婷妍 美麗巴努·玉素甫

白內(nèi)障(cataract)是一種常見的與年齡有關(guān)的疾病，其發(fā)生率持續(xù)上升[1]。由于其發(fā)病機(jī)制不清楚，因此白內(nèi)障的非手術(shù)治療仍然受到限制。晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體中唯一具有分裂活性的細(xì)胞，能夠保持晶狀體的滲透壓、維持其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率比較，白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率明顯增加。體外誘導(dǎo)損傷可以使晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而誘發(fā)晶狀體皮質(zhì)發(fā)生混濁，進(jìn)而導(dǎo)致白內(nèi)障的形成[3]。氧化損傷可能是白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，與年齡相關(guān)的白內(nèi)障患者的晶狀體中活性氧含量(ROS)顯著升高[6]。

H2O2是眾多氧化損傷產(chǎn)物中最重要的物質(zhì)。目前H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡已成為白內(nèi)障形成的細(xì)胞模型被廣泛研究[7]。微小RNA(miRNA)是一類微小的非編碼RNA，通過與其靶標(biāo)miRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)中的互補(bǔ)序列結(jié)合，miRNA可以誘導(dǎo)miRNA降解或翻譯抑制[8]。研究表明，miRNA參與多種生理和病理過程[9]。比如，一些miRNA與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)作有關(guān)，這表明miRNA可能成為白內(nèi)障診斷和治療的新靶點[10]。miR-211在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的晶狀體中異常表達(dá)，可促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[11]。Wang等[12]研究表明，miR-630在白內(nèi)障患者的晶狀體中表達(dá)上調(diào)，但是目前 miR-630在白內(nèi)障中的具體作用和機(jī)制還未見相關(guān)研究。因此，本研究使用H2O2刺激人晶狀體上皮細(xì)胞，體外建立白內(nèi)障形成模型，探究miR-630對人晶狀體上皮細(xì)胞增殖、遷移和氧化損傷的影響，探討其在白內(nèi)障發(fā)病過程中可能的作用和機(jī)制，并為miR-630成為白內(nèi)障靶向治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.材料：人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清和CCK-8試劑盒購自美國Gibco公司；H2O2購自美國Sigma公司；TRIzol試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒和BCA試劑盒購自英國Abcam公司；陰性對照(miR-NC)、帶熒光標(biāo)簽GFP的miR-630 inhibitor由Genepharma公司合成；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；RIPA裂解液和ROS檢測試劑盒購自上海碧云天有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；兔抗Bcl-2抗體、兔抗Akt抗體、山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：HLE-B3細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分。將細(xì)胞分為4組：①對照組：不進(jìn)行任何處理；②H2O2組：加入H2O2(300μmol/L)進(jìn)行處理[7]；③H2O2+陰性對照組(H2O2+miR-NC)：轉(zhuǎn)入陰性對照，并用H2O2(300μmol/L)進(jìn)行處理；④H2O2+miR-630抑制劑組(H2O2+miR-630 inhibitor組)：轉(zhuǎn)入miR-630抑制劑，并加入H2O2(300μmol/L)進(jìn)行處理。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與H2O2處理：取處于對數(shù)生長期的HLE-B3細(xì)胞經(jīng)消化后，接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長融合至 60%～80%時，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將100nmol/L的miR-NC、miR-630 inhibitor分別轉(zhuǎn)入HLE-B3中。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后，加入H2O2(300μmol/L)培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

4.qRT-PCR：用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA。用Nanodrop 2000儀器測量樣品總RNA濃度，并將每個配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。然后按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。使用FTC-3000p實時PCR系統(tǒng)完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。其中使用的引物詳見表1。

5.細(xì)胞集落形成實驗：將HLE-B3細(xì)胞按照1×106個/孔接種到6孔板中，待細(xì)胞融合至60%～80%，按照材料與方法3進(jìn)行處理。培養(yǎng)72h后，收集各組細(xì)胞并接種到60mm的培養(yǎng)皿中。3天更換一次培養(yǎng)基。10天后用結(jié)晶紫染色，并計數(shù)含有≥50個細(xì)胞的集落，并進(jìn)行拍照。

表1 引物序列

6. EdU實驗：將HLE-B3細(xì)胞以1.6×105個細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，待細(xì)胞融合至60%～80%，按照材料與方法3進(jìn)行處理。培養(yǎng)72h后，隨后，向每個孔中加入50mmol/L的5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)，并在37℃下孵育4h。然后將細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15min，并在室溫下用0.5% Triton X-100處理20min以進(jìn)行透化。將細(xì)胞與100ml Apollo混合物在室溫下孵育30min，用100ml Hoechst33342染色30min，并在熒光顯微鏡下成像。使用Image-Pro Plus軟件6.0版來計算EdU陽性細(xì)胞(紅色細(xì)胞)的數(shù)量。EdU摻入效率表示為HLE-B3陽性細(xì)胞(藍(lán)色細(xì)胞)中EdU陽性細(xì)胞的比例。

7.細(xì)胞劃痕愈合實驗：HLE-B3細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液，然后細(xì)胞按照1×105個/孔接種在6孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞生長融合至60%～80%時，按材料與方法3進(jìn)行處理。待各組細(xì)胞長滿后，用200μl無菌移液管在細(xì)胞單層做線性劃痕，立即在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照，并在48h后觀察遷移的距離。使用Image J軟件測量各組細(xì)胞遷移的距離。

8.流式細(xì)胞術(shù)：收集轉(zhuǎn)染并處理后的各組細(xì)胞，離心并重懸于緩沖液中。將細(xì)胞依次用異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)溶液(10μl)和碘化丙啶(PI)溶液(10μl)染色。將染色的細(xì)胞在室溫下黑暗中孵育30min，然后使用FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

9.ROS水平和SOD的含量測定：(1)ROS水平測定：用無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μmol/L。用稀釋好的DCFH-DA溶液重懸各組細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1×106個/毫升，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育20min。用無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，然后使用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488nm和525nm。(2)SOD含量測定：各組細(xì)胞按材料與方法3處理，72h后用移液槍吸出細(xì)胞上清液，并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，然后嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行后續(xù)實驗，最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度值。

10.Western blot法：轉(zhuǎn)染并處理后的各組細(xì)胞用RIPA裂解提取總蛋白，并通過BCA方法進(jìn)行定量，樣品經(jīng)變性后進(jìn)行上樣。按照實驗步驟進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉(5%脫脂奶粉)-一抗孵育[兔抗Bcl-2 抗體(1∶1000)、兔抗Akt抗體(1∶1000)，4℃過夜]-二抗孵育[山羊抗兔IgG抗體(1∶2000)，室溫1h]-顯影曝光。Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.miR-630在HLE-B3細(xì)胞中的表達(dá)：在miR-NC及miR-630 inhibitor轉(zhuǎn)染入HLE-B3細(xì)胞48h后，熒光檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miR-630 inhibitor的HLE-B3細(xì)胞中可見攜帶GFP綠色熒光蛋白，表明轉(zhuǎn)染成功(圖1A)。各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，提取其總miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗證，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細(xì)胞中miR-630的表達(dá)水平上調(diào)(P均=0.000)，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細(xì)胞中的miR-630表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細(xì)胞中的miR-630表達(dá)水平明顯下調(diào)(P均=0.000，圖1B)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.miR-630對HLE-B3細(xì)胞形態(tài)的影響：與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細(xì)胞表現(xiàn)出棒狀或長紡錘形形態(tài)，細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸失調(diào)，細(xì)胞散布排列；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細(xì)胞具有上皮特征，呈立方狀且規(guī)則排列，細(xì)胞排列相對緊密(圖2)。

圖1 miR-630在HLE-B3細(xì)胞中的表達(dá)情況A.鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)的情況(×200)；B.qRT-PCR檢測miR-630在HLE-B3細(xì)胞中的表達(dá)情況；與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與H2O2組比較，#P=0.000；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP=0.000

圖2 miR-630對HLE-B3細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

3.miR-630對HLE-B3細(xì)胞增殖能力的影響：細(xì)胞集落形成實驗表明(圖3A)，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細(xì)胞的增殖能力顯著下降(P均=0.000)； 與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細(xì)胞的增殖能力明顯提高(P均<0.01)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。EdU實驗結(jié)果表明(圖3B)，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組中的EdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P均=0.000)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組中的EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P均<0.01)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 miR-630對HLE-B3細(xì)胞增殖的影響A.細(xì)胞集落形成實驗檢測HLE-B3細(xì)胞的增殖情況；B.EdU分析HLE-B3細(xì)胞的增殖情況；與對照組比較，*P<0.05，**P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.01；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.01

4.miR-630對HLE-B3細(xì)胞遷移的影響：細(xì)胞劃痕愈合實驗表明，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細(xì)胞的遷移能力顯著下降(P均=0.000)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細(xì)胞的遷移能力提高(P均<0.05)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖4 miR-630對HLE-3細(xì)胞遷移的影響與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.05；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.05

5.miR-630對HLE-B3細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細(xì)胞的凋亡能力顯著提高(P均=0.000)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細(xì)胞的凋亡能力顯著下降(P均=0.000)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

6.miR-630對HLE-B3細(xì)胞中ROS水平和SOD含量的影響：與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組中ROS水平上調(diào)(P均=0.000)，SOD含量減少(P=0.000)；與 H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組中ROS水平下調(diào)(P均<0.01)，SOD含量增加(P<0.05)；H2O2組和H2O2+miR-NC組中兩者變化均不大，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖6)。

圖5 miR-630對HLE-3細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，*P=0.000；與H2O2組比較，#P=0.000；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP=0.000

圖6 miR-630對HLE-B3細(xì)胞中ROS水平和SOD含量的影響A.miR-630對HLE-B3細(xì)胞中ROS水平的影響;B.miR-630對HLE-B3細(xì)胞中SOD含量的影響;與對照組比較，*P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.05,##P<0.01；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01

7.miR-630對HLE-B3細(xì)胞中Bcl-2和Akt蛋白表達(dá)的影響：Western blot法結(jié)果表明，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組中Bcl-2和Akt蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P均=0.000)；與 H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組中Bcl-2和Akt蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01，P<0.05)；H2O2組和H2O2+miR-NC組中兩者變化均不大，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖7)。

討 論

白內(nèi)障是最常見的眼科疾病之一，也是視力障礙或視力喪失的主要原因之一[13]。目前對該病的治療幾乎完全是外科手術(shù)，白內(nèi)障手術(shù)是對65歲以上的患者進(jìn)行的最常見的外科手術(shù)[14]。手術(shù)治療雖然有效，但通?；ㄙM較大，并給患者帶來恐懼[15]。因此，對白內(nèi)障的有效非手術(shù)干預(yù)進(jìn)行研究是一項重要嘗試，具有廣泛的應(yīng)用前景和社會效益。

圖7 miR-630 對HLE-B3細(xì)胞中Bcl-2和Akt蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，*P<0.05，**P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.05，##P<0.01；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

miRNA是一類小的非編碼RNA，具有至關(guān)重要的基因調(diào)節(jié)功能，該功能通過與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合而起作用[16]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在哺乳動物晶狀體的多個病理過程中起關(guān)鍵作用[17]。研究表明，miR-26、miR-30a和miR-211通過靶向某些mRNA參與白內(nèi)障的形成[18～20]。有文獻(xiàn)報道，miR-630在白內(nèi)障患者的晶狀體中表達(dá)上調(diào)，但是miR-630在白內(nèi)障中的具體作用和機(jī)制還未見相關(guān)研究[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞時，使HLE-B3細(xì)胞中miR-630的表達(dá)上調(diào)，這與miR-630在白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)結(jié)果相一致。

在白內(nèi)障的形成過程中，晶狀體上皮細(xì)胞會發(fā)生大量凋亡，并且有研究表明，H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷能引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[21]。本研究通過給予HLE-B3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-630 inhibitor使miR-630低表達(dá)，來探究miR-630對晶狀體上皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響。結(jié)果表明，與 H2O2組和H2O2+miR-NC比較，低表達(dá)miR-630增加了HLE-B3細(xì)胞的增殖能力、遷移能力，降低了HLE-B3細(xì)胞的凋亡率。研究報道，多種刺激物可能在眼中產(chǎn)生氧自由基，并且所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激在白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[22]。

氧化應(yīng)激代表氧化劑和抗氧化劑之間的平衡發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致組織中的ROS增加。ROS表達(dá)增加通常與病理相關(guān)，并與引起細(xì)胞衰老、凋亡和壞死有關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障患者晶狀體中的ROS水平顯著上調(diào)[6]。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動物、植物、微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào) miR-630表達(dá)能夠降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi) ROS水平，增加SOD的含量。結(jié)果表明，下調(diào)miR-630表達(dá)可能減少H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷。Bcl-2和Akt是重要的抗凋亡基因，通過抑制超氧陰離子的過多產(chǎn)生或抑制線粒體通透性的改變，阻止線粒體膜轉(zhuǎn)膜電位的下降，從而抑制細(xì)胞凋亡[24]。因此，本研究探究了H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中miR-630與Bcl-2和Akt的關(guān)系。結(jié)果表明，在人晶狀體上皮細(xì)胞中，低表達(dá)miR-630能夠上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的Bcl-2和Akt的表達(dá)。

綜上所述，低表達(dá)miR-630可能增加H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、遷移，抑制其凋亡與氧化損傷，其可能與Bcl-2和Akt的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。因此，miR-630可能是治療白內(nèi)障的潛在靶點。