魏曉藝 車(chē)念聰 張哲滔 田 甜 彭思揚(yáng) 劉 柯 鄭亞琳
現(xiàn)代常見(jiàn)的高糖高脂飲食習(xí)慣是導(dǎo)致或加重糖脂代謝異常情況的重要因素。與糖脂代謝異常相關(guān)的疾病發(fā)生率也逐漸提升,其中,糖尿病是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng),飲食結(jié)構(gòu)西化,人口流動(dòng)性變化,使得中國(guó)的糖尿病發(fā)生率大幅上升。與2001年全國(guó)性調(diào)查報(bào)道的5.5%的發(fā)生率比較, 2010年這一比例已經(jīng)上升到11.6%。基于此的預(yù)測(cè)表明,中國(guó)擁有世界上最多的糖尿病患者。一項(xiàng)前瞻性研究認(rèn)為,肥胖、高血壓和血脂異常與2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)[1~3]。人體腸道中寄居著大量厭氧和需氧細(xì)菌群體,可以通過(guò)能量代謝、免疫調(diào)節(jié)和炎癥機(jī)制等多種途徑影響肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等多種代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展。腸道細(xì)菌數(shù)量可達(dá)到100萬(wàn)億,占有量較大的為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)等[4,5]。本研究采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)正常組和鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高糖高脂飲食誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的特征進(jìn)行了初步分析,旨在探索腸道菌群與血糖、血脂的關(guān)系,為通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)改善血糖、血脂代謝提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1.動(dòng)物及模型制備:本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)審核通過(guò)(倫理編號(hào):AEEI-2017-019)。造模方法延續(xù)課題組的前期研究[6]。SPF級(jí)雄性SD大鼠16只,體質(zhì)量180~200g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF級(jí)動(dòng)物房。室溫保持在22±2℃,相對(duì)濕度為26%±2%,按正常晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)光照時(shí)間。在使用普通飼料進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后,采用隨機(jī)數(shù)字表,將動(dòng)物分為正常組(Z組)和模型組(M組),每組8只。正常組動(dòng)物予以普通飼料,模型組動(dòng)物飼以高糖高脂飼料(基礎(chǔ)飼料58.8%,豬油10%,蔗糖20%,膽鹽0.2%,蛋黃粉10%,膽固醇1%)。飼養(yǎng)4周后,所有大鼠禁食12h,模型組大鼠經(jīng)腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液配制的1%鏈脲佐菌素(STZ),劑量為35mg/kg;正常組大鼠經(jīng)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。注射1周后經(jīng)尾尖采血檢測(cè)造模組大鼠空腹血糖,以空腹血糖>16.7mmol/L為造模成功。模型組大鼠以高糖高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng),每周定時(shí)測(cè)空腹血糖、體質(zhì)量。首次注射STZ后對(duì)模型組大鼠血糖進(jìn)行檢測(cè),有1只大鼠空腹血糖不達(dá)標(biāo),以同樣方法補(bǔ)注,1周后復(fù)測(cè)血糖仍<16.6mmol/L,故淘汰;正常組大鼠死亡1只,故實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),正常組存活大鼠7只,模型組7只。飼養(yǎng)全過(guò)程中動(dòng)物自由飲食飲水。第14周末,動(dòng)物隔夜禁食12h,次日先經(jīng)尾靜脈采血檢測(cè)大鼠空腹血糖及體質(zhì)量,后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,靜置約2h后3000r/min離心15min,取血清凍存于-20℃冰箱備用;剖腹,取盲腸內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管中,快速放入-80℃冰箱中保存。
2.血生化指標(biāo)的測(cè)定:采用日本奧林巴斯株式會(huì)社全自動(dòng)生化儀AU480檢測(cè)各組大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量;羅氏血糖儀(活力型)檢測(cè)大鼠空腹血糖(GLU);放免法檢測(cè)血清胰島素(INS);穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),即空腹血清胰島素×空腹血糖/22.5,以評(píng)價(jià)胰島素抵抗(IR)水平。
3.腸道菌群結(jié)構(gòu)的檢測(cè):稱(chēng)取150~200mg糞便,首先抽提細(xì)菌總DNA,后對(duì)其DNA純度進(jìn)行測(cè)定。將樣本在冰上融化后,充分混勻并離心,取適量樣本,采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其DNA純度和濃度;采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)DNA完整性。隨后將樣本保存至-80℃冰箱,純度合格可進(jìn)行腸內(nèi)容物微生態(tài)檢測(cè)。對(duì) OTU 豐度矩陣中每個(gè)樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機(jī)抽樣,以每個(gè)深度下抽取到的序列數(shù)及其對(duì)應(yīng)的 OTU 數(shù)繪制稀疏曲線(xiàn)。得到 OTU 稀疏曲線(xiàn),如圖1稀釋曲線(xiàn)所示,在隨機(jī)抽取的序列總數(shù)達(dá)到15000以后趨于平緩。測(cè)序深度達(dá)標(biāo),可進(jìn)行后續(xù)多樣評(píng)估。在檢測(cè)樣本中微生物DNA序列后,根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行劃分,每個(gè)OTU的代表序列用于分類(lèi)地位鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。根據(jù)OTU在不同樣本中的豐度分布,評(píng)估每個(gè)樣本的多樣性水平。最后,對(duì)各樣本(各組之間)在不同分類(lèi)水平的具體組成進(jìn)行分析。
圖1 稀釋曲線(xiàn)
1.大鼠體質(zhì)量情況:模型組大鼠在注射STZ后體質(zhì)量迅速減輕,且后續(xù)增重較慢,最終體質(zhì)量明顯低于正常大鼠。與正常組比較,模型組大鼠反應(yīng)遲緩,毛色黃暗成縷,糞便稀軟。體質(zhì)量情況如表1所示。
表1 大鼠體質(zhì)量情況
與正常組比較,*P<0.05
2.血脂與糖代謝情況:模型組大鼠LDL-C和INS高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組的TC、TG、GLU和HOMA-IR與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);兩組間HDL-C水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見(jiàn)表2。
表2 血脂與糖代謝情況
與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01
3.腸道菌群整體結(jié)構(gòu):正常組、模型組共檢測(cè)出1317個(gè)OTU,其中共有OTU 507個(gè),僅占38.5%,兩組間豐度差異較大(圖2A),正常組獨(dú)占的OTU有241個(gè),為不受糖脂代謝紊亂因素影響存在的;模型組獨(dú)占的OTU為62個(gè),為受糖脂代謝紊亂影響產(chǎn)生的。如圖2B所示,正常組與模型組的點(diǎn)總體分布較為分散。
圖2 腸道菌群整體結(jié)構(gòu)圖A.維恩圖;B.PCA圖,百分比表示主成分對(duì)樣本組成差異的貢獻(xiàn)值。橫、縱坐標(biāo)軸的刻度是相對(duì)距離,無(wú)實(shí)際意義
4.腸道菌群Alpha多樣性:在進(jìn)行微生物群落豐富度和多樣性分析時(shí),常用Sobs、Chao、ace指數(shù)來(lái)描述群落物種的豐富度,用Shannon、Simpson指數(shù)來(lái)反映物種的多樣性。與前述其他4個(gè)指數(shù)不同,Simpson指數(shù)的值與其所反映的指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。如表3所示,模型組的Sobs、Chao、ace、Shannon指數(shù)均顯著低于正常組(P<0.01);與模型組比較,正常組的Simpson指數(shù)較低(P<0.01)。
表3 腸道菌群微生物Alpha多樣性系數(shù)表
與正常組比較,*P<0.01
圖3 群落組成柱形圖(門(mén))
5.腸道菌群物種注釋及差異分析:在門(mén)這一級(jí)別檢測(cè)出的主要種類(lèi),厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、無(wú)壁菌門(mén)(Tenericutes)豐度依次遞減(圖3)。其中放線(xiàn)菌門(mén)在模型組中比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),詳見(jiàn)表4。在門(mén)這一級(jí)別檢測(cè)出5類(lèi)細(xì)菌在兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中正常組的藍(lán)藻菌門(mén)、Saccharibacteria菌門(mén)顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);放線(xiàn)菌門(mén)、螺旋體(Spirochaetae)和某無(wú)分類(lèi)細(xì)菌(unclassified_k_norank)在模型組中的比例明顯高于正常組(P<0.05,圖4)。在綱這一級(jí)別中,梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、芽胞桿菌綱(Bacilli)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、Negativicutes鋼、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)和放線(xiàn)菌綱為豐度較高的菌屬。其中梭菌綱(屬厚壁菌門(mén))在正常組大鼠的腸道菌群中比例大于模型組;放線(xiàn)菌綱(屬放線(xiàn)菌門(mén))在模型組大鼠腸道菌群中比例更高,二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5)。在所有菌目中,檢出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的為梭菌目(Clostridiales)和紅蝽菌目(Coriobacteriales)(屬放線(xiàn)菌門(mén))在模型組大鼠菌群中比例更低(P<0.05),雙歧桿菌(Bifidobacteriales,屬放線(xiàn)菌門(mén))在模型組大鼠菌群中比例更高(P<0.05,圖6)。
表4 兩組大鼠主要腸道菌群差異的比較
與正常組比較,*P<0.01
圖4 正常組與模型組大鼠腸道菌群差異分析(門(mén))圓點(diǎn)顏色顯示為物種豐度占比較大的分組顏色,圓點(diǎn)上的Ⅰ型區(qū)間為差值的上下限值;與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01
圖5 正常組與模型組大鼠腸道菌群差異分析(綱)與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01
圖6 正常組與模型組大鼠腸道菌群差異分析(目)與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01
采用LefSe多級(jí)物種差異判斷分析,比較正常組大鼠和模型組大鼠腸道菌群豐度在各級(jí)分類(lèi)水平下的差異,如圖7所示,圓圈由內(nèi)向外依次為門(mén)、綱、目。由此可見(jiàn)此模型可引起7個(gè)分類(lèi)水平的微生物群的上調(diào),其中4個(gè)與放線(xiàn)菌門(mén)相關(guān);另外造成梭菌門(mén)等20個(gè)分類(lèi)水平微生物群的降低。
圖7 基于分類(lèi)等級(jí)樹(shù)的組間差異分類(lèi)單元展示圖圓圈由內(nèi)向外依次為門(mén)、綱、目。淡黃色節(jié)點(diǎn)表示在組間無(wú)顯著差異; 紅色節(jié)點(diǎn)表示在該水平上下調(diào)的微生物類(lèi)群;藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示在該水平上上調(diào)的微生物類(lèi)群
6.糖脂代謝指標(biāo)與菌群的相關(guān)性分析:當(dāng)模型組TG異常時(shí),脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)、變形菌門(mén)、Saccharibacteria菌門(mén)比例改變(P<0.05),與TG的變化呈負(fù)相關(guān);當(dāng)TC異常時(shí),脫鐵桿菌門(mén)含量改變(P<0.05),Saccharibacteria、藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)發(fā)生顯著變化(P<0.01);HOMA-IR的變化與放線(xiàn)菌門(mén)的比例呈正相關(guān),與Saccharibacteria、藍(lán)藻菌門(mén)和柔膜菌門(mén)(Tenericutes)的比例呈負(fù)相關(guān)(圖8)。
圖8 TG、TC、HOMA-IR與腸道菌群(門(mén))相關(guān)性熱圖紅色方框代表某微生物類(lèi)群與環(huán)境呈正相關(guān);藍(lán)色方框代表某微生物類(lèi)群與環(huán)境呈負(fù)相關(guān);*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000
糖脂代謝紊亂常見(jiàn)于糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、肥胖等疾病。對(duì)于這一病理狀態(tài)而言,分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)以及找到某類(lèi)特殊菌種,可以為揭示其發(fā)生原因提供支持。本實(shí)驗(yàn)延續(xù)課題組前期基礎(chǔ),采用小劑量(35mg/kg)注射STZ的造模方法,破壞胰島β細(xì)胞,早期造成胰島素分泌不足,大鼠血糖逐漸升高[7]。在高糖高脂飼料喂養(yǎng)下,大鼠血糖持續(xù)保持高水平,使得胰島β細(xì)胞代償性分泌大量胰島素,表現(xiàn)為高胰島素血癥狀態(tài);因胰島β細(xì)胞的增殖性在出生后急劇下降,且再生性低,同時(shí)飼以高糖高脂飼料,血糖調(diào)節(jié)失代償,大鼠始終處于高血糖狀態(tài)[8]。持續(xù)的高血糖、高血脂和高胰島素血癥導(dǎo)致胰島素抵抗,表現(xiàn)為糖脂能量利用和儲(chǔ)存紊亂的狀態(tài)[9]。有研究者研究腸道菌群發(fā)現(xiàn),低微生物豐度者患代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高[10]。另有研究者通過(guò)調(diào)查肥胖與正常人群的腸道菌群后認(rèn)為,低微生物豐度組的人群常伴有高胰島素癥、體脂增高、高甘油三酯血癥,提示這類(lèi)人群罹患糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增高[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)16S高通量技術(shù)分別對(duì)兩組大鼠腸道菌群進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。通過(guò)對(duì)OTU的比較,筆者觀(guān)察到模型組大鼠的腸道菌群多樣性較正常組顯著降低,與一些非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、肥胖等代謝疾病模型的菌群特征表現(xiàn)相合,而菌群結(jié)構(gòu)改變和糖脂代謝紊亂的因果關(guān)系,還有待于進(jìn)一步研究[12~14]。
另外,許多研究發(fā)現(xiàn)一種厚壁菌門(mén)代謝產(chǎn)物丁酸鹽具有抗炎、改善胰島素抵抗的作用,高糖高脂飲食導(dǎo)致厚壁菌的減少,可能與肥胖、IR及糖尿病的發(fā)生有關(guān)[15,16]。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的結(jié)果提示,模型組厚壁菌門(mén)的比例較正常組略低,模型組胰島素抵抗程度較正常組的增高可能與厚壁菌的減少有關(guān)。進(jìn)一步在綱的水平上探究其的變化,結(jié)果顯示厚壁菌門(mén)級(jí)別上的差異主要由梭菌綱(Clostridia)導(dǎo)致。在既往研究中,Jia等發(fā)現(xiàn)非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠梭菌的相對(duì)豐度與空腹血糖呈負(fù)相關(guān),并推測(cè)機(jī)制為丁酸梭菌CB0313.1通過(guò)參與2型免疫,調(diào)節(jié)T細(xì)胞而形成富集梭菌的環(huán)境,從而延緩和(或)抑制NOD 小鼠1型糖尿病的發(fā)生[17]。一項(xiàng)針對(duì)345例中國(guó)T2DM患者腸道菌群的研究顯示,糖尿病患者腸道菌群中一些產(chǎn)生丁酸鹽的厚壁、梭菌等豐度降低,厚壁菌門(mén)和梭菌綱的比例顯著減少[18]。本次研究顯示,與正常組比較,模型組的梭菌綱豐度顯著降低,說(shuō)明梭菌可能是糖尿病發(fā)展中的一類(lèi)標(biāo)志細(xì)菌,與糖尿病的發(fā)生及糖脂代謝紊亂相關(guān)。另外,一些梭菌被證實(shí)與維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)有關(guān),腸黏膜通透性的改變也與糖脂代謝紊亂有關(guān)[19,20]。關(guān)于梭菌的其他作用以及影響糖脂代謝的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
有研究者針對(duì)2型糖尿病、胰島素抵抗、肥胖等開(kāi)展的研究發(fā)現(xiàn),患病組腸道菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為高厚壁菌低擬桿菌的狀態(tài)。而Zhou等[21]和Larsen等[22]的研究發(fā)現(xiàn),模型組腸道菌群出現(xiàn)了厚壁菌門(mén)比例低、擬桿菌門(mén)比例高的情況。在本次小樣本的研究數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn),模型組擬桿菌比例較正常組也有上升趨勢(shì),二者的所占比例可能與糖脂代謝存在相關(guān)性,后續(xù)可進(jìn)行大樣本量數(shù)據(jù)研究,以明確其與糖脂代謝紊亂的具體關(guān)系。除厚壁菌、擬桿菌外,放線(xiàn)菌也是人體腸道菌群內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌種。在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)中,放線(xiàn)菌是酶抑制劑的重要新來(lái)源,對(duì)控制糖尿病、肥胖癥、高脂血癥等碳水化合物依賴(lài)性疾病也有較高價(jià)值。然而目前鮮有放線(xiàn)菌和糖脂代謝互作機(jī)制的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)模型組放線(xiàn)菌門(mén)的比例顯著增加,而同樣屬于放線(xiàn)菌綱的紅椿菌和雙歧桿菌在模型組中的比例相反,這可能表明不同的放線(xiàn)菌群之間存在拮抗關(guān)系;另外放線(xiàn)菌門(mén)與HOMA-IR的相關(guān)性較大,說(shuō)明在高糖高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂模型中放線(xiàn)菌可能是潛在的標(biāo)志性菌,可能會(huì)為從菌群方面調(diào)控糖脂代謝紊亂狀態(tài)的研究提供一定的參考。