Kv1.3鉀通道調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1受體攝取oxLDL

何 軍 韓一品 孫 賓 王 浩 楊 震

電壓門控性鉀通道Kv1.3是維持細(xì)胞靜息膜電位最重要的離子通道之一，在細(xì)胞生理性電活動(dòng)和心律失常中發(fā)揮重要作用。人類的Kv1.3鉀通道由位于染色體1P13.3的Kv1.3基因(又稱KCNA3基因)編碼，含523個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)由4個(gè)相同的α亞基組成，每個(gè)亞基包括1個(gè)N-末端、6個(gè)跨膜片段(S1～S6)和1個(gè)C-末端[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Kv1.3的特異性阻斷劑Margatoxin可以顯著降低人巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量、抑制泡沫細(xì)胞形成[2]。給予動(dòng)脈粥樣硬化大鼠皮下注射Kv1.3的另一種特異性阻斷劑?？窠?jīng)毒素ShK，可使主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚和中層平滑肌排列紊亂減輕[3]。這些研究提示Kv1.3 可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，但詳細(xì)機(jī)制并不十分明了。

血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)是內(nèi)皮細(xì)胞主要的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)受體，最早是由牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞克隆所得[4,5]。目前有研究者認(rèn)為L(zhǎng)OX-1也屬一種動(dòng)脈硬化發(fā)生前的致炎性細(xì)胞因子，可通過多條信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá), 在內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，臨床廣泛使用的某些他汀類藥物不僅可使粥樣斑塊退縮，還有抗心律失常的作用,提示動(dòng)脈粥樣硬化與心律失常間可能有共同的分子調(diào)控機(jī)制，也可能二者相互調(diào)控。由此筆者設(shè)想，Kv1.3通過調(diào)節(jié)LOX-1攝取oxLDL而促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。本研究通過慢病毒介導(dǎo)的細(xì)胞感染、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)和Western blot等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的Kv1.3蛋白表達(dá)水平后，在細(xì)胞膜鉀電流發(fā)生明顯變化的同時(shí)，還引起細(xì)胞LOX-1表達(dá)水平、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和膽固醇水平的顯著變化。由此，筆者認(rèn)為Kv1.3通過LOX-1參與調(diào)節(jié)了HUVECs攝入oxLDL。本研究為闡明LOX-1結(jié)合oxLDL的電壓依賴性機(jī)制增添了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也為闡釋Kv1.3參與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)研究打開了新的視角。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):HUVECs以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．慢病毒載體構(gòu)建與包裝：重組表達(dá)質(zhì)粒(包括shRNA干擾慢病毒表達(dá)載體LV3-pGLV-h1-GFP-puro、Kv1.3過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體LV5-EF1a-GFP-Puro)和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)由上海吉瑪公司構(gòu)建制備。采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司，貨號(hào)12362)抽提質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA 溶于除菌的TE 緩沖液中，以紫外光吸收法測(cè)定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNAA260/A280為1.8～2.0。以293T細(xì)胞包裝載體，獲得效價(jià)≥1×108TU/ml的慢病毒原液。

3.穩(wěn)定表達(dá)Kv1.3的HUVEC的篩選與鑒定:取病毒原液以適當(dāng)MOI感染HUVECs細(xì)胞，72h后加入Puromycin(終濃度2μg/ml)。之后每2～3天換一次含Puromycin的新鮮培養(yǎng)液。藥物篩選約7天后，收集細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，行PCR和Western blot法以驗(yàn)證Kv1.3上調(diào)和下調(diào)的效果。

4．HUVEC膜電位檢測(cè)：采用手動(dòng)膜片鉗技術(shù)，記錄Kv1.3基因過表達(dá)和下調(diào)的HUVECs 膜電位變化。將1ml含HUVECs的外液加入膜片鉗小槽中，待細(xì)胞沉降至底部，開始鉗夾細(xì)胞，全細(xì)胞記錄模式形成后運(yùn)行Kv1.3(I/V曲線)程序。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將不同去極化電壓下記錄到的Kv1.3電流密度作縱坐標(biāo)、以去極化電壓為橫坐標(biāo)制作I/V曲線：每10s 脈沖刺激細(xì)胞記錄Kv1.3鉀電流峰值，即先將電壓鉗制在-80mV，給予細(xì)胞持續(xù)500ms去極化，刺激電壓步階為10mV。

5.油紅O染色：油紅O溶液配制：1g油紅O干粉加100ml異丙醇，60℃水浴使充分溶解成母液，4℃避光保存。使用前母液與超凈水以3∶2混勻并用無菌過濾器過濾，此為工作液。染色：吸去培養(yǎng)液，以PBS洗HUVECs 3次，以4%甲醛室溫固定1h，再以PBS洗細(xì)胞1次，加入油紅O工作液染色30min。富含脂質(zhì)的細(xì)胞被染成紅色。染色完畢在顯微鏡下觀察并拍照。

6.HUVECs內(nèi)膽固醇含量測(cè)定：利用比色法檢測(cè)HUVECs膽固醇水平，試劑盒(貨號(hào)A111-2)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將Kv1.3過表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的HUVECs分別與oxLDL(終濃度60μg/ml)共孵育48h后，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。樣本中加0.5ml PBS，置冰水中旋轉(zhuǎn)碾磨3min，取樣50μl測(cè)定。將各管反應(yīng)物混勻、37℃反應(yīng)5min，500nm測(cè)定各管A值。計(jì)算公式如下：TC含量(mmol/g 蛋白質(zhì))=[(樣本管A-空白管A)÷(校準(zhǔn)管A-空白管A)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5.17mmol/L)÷5÷待測(cè)樣本蛋白濃度(mg/ml)。

7．Western blot法檢測(cè)：應(yīng)用RIPA Buffer(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào)R0278)提取HUVECs總蛋白，簡(jiǎn)述如下：將各組細(xì)胞以冰浴的PBS洗1次，加入適量RIPA Buffer，置冰上5min后，快速刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)至EP管，置冰上裂解15min后，8000×g、4℃離心15min，收集上清。采用Bio-Rad DC 蛋白檢測(cè)試劑盒(英國(guó)Bio-Rad Laboratories有限公司, 貨號(hào)500-0116)測(cè)定蛋白濃度。采用12% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，半干式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉后，用相應(yīng)的一抗雜交，繼之以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育。應(yīng)用ECL Select (美國(guó)GE Healthcare公司, 貨號(hào)RPN2235) 使二抗顯影，采用Multi Doc-it 圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP有限公司)成像，灰度定量分析采用Image J軟件。所用一抗信息如下：anti-Kv1.3 (美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)WH0003738M1，1∶500)，anti-LOX-1(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào)ab60178，1∶300), anti-P38(美國(guó)Cell Signaling Technologies公司,貨號(hào)9212,1∶1000)，anti-p-P38(美國(guó)Cell Signaling Technologies公司,貨號(hào)9211, 1∶1000)，anti-GAPDH(康成生物，貨號(hào)KC-5G4, 1∶5000)，anti-β-actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bs-0061R，1∶3000)。

結(jié) 果

1.Kv1.3干擾效率和過表達(dá)效率檢測(cè)：與病毒對(duì)照組比較，shRNA950組和shRNA1646組Kv1.3 mRNA表達(dá)水平降低(P均<0.05)。經(jīng)Western blot法檢測(cè)，僅shRNA950組Kv1.3蛋白水平降低，與病毒對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明利用該干擾病毒可達(dá)到下調(diào)Kv1.3蛋白表達(dá)的目的，故后續(xù)下調(diào)Kv1.3蛋白表達(dá)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均采用shRNA950干擾載體(圖1)。

圖1 shRNA干擾效率鑒定結(jié)果(HUVECs感染7天)A.Kv1.3 mRNA表達(dá)水平，與空白對(duì)照組比較,*P<0.05；B.Kv1.3 蛋白表達(dá)水平，與病毒對(duì)照組比較,#P<0.05

Kv1.3過表達(dá)載體組Kv1.3 mRNA水平(圖2A)和蛋白表達(dá)水平(圖2B)與空白對(duì)照組比較明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明載體構(gòu)建是成功的。

圖2 Kv1.3過表達(dá)效率鑒定結(jié)果(HUVECs感染7天)A.Kv1.3 mRNA表達(dá)水平；B.Kv1.3 蛋白表達(dá)水平。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.HUVEC細(xì)胞Kv1.3電流變化：隨著去極化電壓的增大，Kv1.3過表達(dá)組(紅線)和對(duì)照組(黑線)的鉀電流密度均增大，以過表達(dá)組更甚，當(dāng)電壓為-10mV和0mV時(shí)，電流密度在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。以鉀通道阻滯劑Quinidine(奎尼丁)處理細(xì)胞后，鉀電流密度呈降低趨勢(shì)(藍(lán)線)，見圖3A。以shRNA950干擾載體感染HUVECs使Kv1.3蛋白表達(dá)下調(diào)后(紅線)，細(xì)胞鉀電流密度較對(duì)照組(黑線)降低，且在去極化電壓為-30mV時(shí)二者之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3B。

圖3 HUVECsKv1.3電流I/V曲線A.與空白對(duì)照組比較,*P<0.05；B.與Kv1.3下調(diào)組比較,#P<0.05

3.油紅O染色結(jié)果：油紅O染色后HUVECs內(nèi)的脂肪滴呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。圖中可見，Kv1.3過表達(dá)組多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴，部分細(xì)胞核固縮；空白對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量淡紅色著色，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形(圖4)。

圖4 HUVECs油紅O染色結(jié)果(×200)A.空白對(duì)照組；B.過表達(dá)組；箭頭所示為細(xì)胞內(nèi)紅染的脂滴

4.HUVECs內(nèi)膽固醇相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果：以oxLDL孵育細(xì)胞后，oxLDL組和(Kv1.3過表達(dá)+oxLDL)組(圖中標(biāo)為“過表達(dá)”)HUVECs內(nèi)膽固醇相對(duì)含量均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。而且，Kv1.3過表達(dá)+oxLDL組的膽固醇相對(duì)含量高于oxLDL組，二者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以shRNA950干擾載體下調(diào)HUVECs Kv1.3 蛋白表達(dá)，并以oxLDL處理細(xì)胞后，shRNA950+oxLDL組膽固醇相對(duì)含量較oxLDL組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 HUVECs內(nèi)膽固醇相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果A.上調(diào)Kv1.3表達(dá)后HUVECs內(nèi)膽固醇食量增加；B.下調(diào)Kv1.3表達(dá)后HUVECs內(nèi)膽固醇含量減少。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05;與oxLDL組比較,#P<0.05

5.Kv1.3上調(diào)/下調(diào)后LOX-1蛋白表達(dá)變化：上調(diào)Kv1.3蛋白表達(dá)后，LOX-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以shRNA950干擾慢病毒下調(diào)Kv1.3蛋白表達(dá)后，LOX-1蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組降低，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

圖6 Western blot法測(cè)定LOX-1蛋白水平A.上調(diào)Kv1.3表達(dá)后LOX-1蛋白水平；B.下調(diào)Kv1.3表達(dá)后LOX-1蛋白水平。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

6.Kv1.3上調(diào)/下調(diào)后p38和磷酸化p38蛋白表達(dá)變化：HUVECs給予oxLDL處理后，Kv1.3過表達(dá)組的p-p38/p38比值較對(duì)照組二者的比值升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。將HUVECs以oxLDL處理后，Kv1.3敲低組的p-p38/p38比值較空白對(duì)照組的比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Kv1.3蛋白水平變化引起的p38蛋白磷酸化水平的改變呈oxLDL依賴性(圖7)。

圖7 Western blot法檢測(cè)p38與磷酸化p38蛋白表達(dá)水平A.Kv1.3表達(dá)上調(diào)后p-p38/p38測(cè)定結(jié)果;B.Kv1.3表達(dá)下調(diào)后p-p38/p38測(cè)定結(jié)果。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05;與對(duì)照組(oxLDL處理)比較,#P<0.01

討 論

LOX-1是一種相對(duì)分子質(zhì)量為50kDa的Ⅱ型膜蛋白，結(jié)構(gòu)上屬于C型血凝素家族，是內(nèi)皮細(xì)胞攝取oxLDL最重要的清道夫受體之一，但在結(jié)構(gòu)上與其他類型的清道夫受體無同源性。LOX-1基因位于人第12號(hào)染色體上，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞外的頸結(jié)構(gòu)域和血凝素樣結(jié)構(gòu)域[7]。血凝素樣功能結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，該結(jié)構(gòu)域維持正電荷對(duì)LOX-1結(jié)合oxLDL極其重要[8]。LOX-1最初被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞攝入oxLDL的主要受體，后來發(fā)現(xiàn)它也是巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞重要的oxLDL受體，因此，在泡沫細(xì)胞和粥樣斑塊形成中扮演重要角色。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，oxLDL以時(shí)間和劑量依賴的方式促進(jìn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞LOX-1表達(dá)[9]。以高脂飼料喂養(yǎng)大鼠18周后，其主動(dòng)脈LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)量增加[10]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者粥樣硬化斑塊處的冠狀動(dòng)脈和梗死心肌LOX-1蛋白表達(dá)增加，急性缺血性腦卒中患者腦血栓處LOX-1蛋白表達(dá)量升高，同時(shí)，患者血清可溶性LOX-1水平升高[11]。細(xì)胞LOX-1的表達(dá)水平主要受其配體調(diào)節(jié)，包括各種修飾的LDL、激活的血小板、糖基化終產(chǎn)物、凋亡小體、細(xì)菌和C反應(yīng)蛋白[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺血、缺氧、鐮刀形紅細(xì)胞也促進(jìn)LOX-1蛋白表達(dá)[4,13]。隨著越來越多LOX-1相關(guān)研究的開展，會(huì)有新的調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)LOX-1的功能與調(diào)控的認(rèn)識(shí)也勢(shì)必會(huì)更新。

Kv1.3主要分布于T淋巴細(xì)胞、腎細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞膜表面。新疆哈薩克族高血壓病患者T淋巴細(xì)胞Kv1.3鉀電流密度增高，可能與T淋巴細(xì)胞的激活有關(guān)[14]。Kv1.3的特異性抗體可降低暴露于oxLDL的人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量、下調(diào)巨噬細(xì)胞LOX-1表達(dá)水平[15]。本研究中，筆者利用攜帶Kv1.3基因的慢病毒載體使Kv1.3在HUVECs呈過表達(dá)或低表達(dá)，觀察LOX-1的蛋白表達(dá)與功能是否隨之改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，感染了Kv1.3干擾慢病毒和過表達(dá)慢病毒的HUVECs，其Kv1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別顯著降低和升高(圖1、圖2)。膜片鉗技術(shù)記錄到HUVECs外向延遲鉀電流的I/V曲線明顯下移和上移，同時(shí)，上調(diào)Kv1.3蛋白表達(dá)引起的外向延遲鉀電流密度增加可被鉀通道阻滯劑奎尼丁所抑制(圖3)。這些數(shù)據(jù)表明，本研究不但使HUVECs的Kv1.3蛋白表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，其鉀通道功能活性也發(fā)生了相應(yīng)的改變，意味著后續(xù)的研究具備了可靠的細(xì)胞模型。

LDL被氧化修飾為oxLDL后，不僅加重血管內(nèi)皮損傷，還經(jīng)LOX-1及其他清道夫受體進(jìn)入細(xì)胞，先轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞、再逐漸形成脂質(zhì)條紋和粥樣斑塊。為了明確Kv1.3對(duì)HUVECs細(xì)胞攝取oxLDL的影響，本研究首先將oxLDL與HUVECs共孵育，經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn)，Kv1.3過表達(dá)組多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴，部分細(xì)胞核固縮；對(duì)照組胞質(zhì)內(nèi)僅見少量淡紅色著色，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形(圖4)。然后經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Kv1.3表達(dá)量上調(diào)后，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯升高，而下調(diào)Kv1.3導(dǎo)致膽固醇含量顯著降低(圖5)。接著，筆者通過Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Kv1.3的上調(diào)或下調(diào)伴隨著LOX-1蛋白表達(dá)量的增強(qiáng)或減弱(圖6)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HUVECs內(nèi)膽固醇含量與Kv1.3蛋白表達(dá)水平有關(guān)，而Kv1.3對(duì)LOX-1表達(dá)水平的調(diào)節(jié)可能是其內(nèi)在原因。

研究表明，LOX-1經(jīng)p38MAPK信號(hào)通路引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、形成泡沫細(xì)胞[7，10]。筆者經(jīng)Western blot 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Kv1.3后p38蛋白磷酸化水平明顯升高，下調(diào)Kv1.3引起p38蛋白磷酸化水平顯著降低，而且呈oxLDL依賴性(圖7)。該結(jié)果提示，p38信號(hào)通路可被oxLDL激活，并可能參與調(diào)控HUVECs膜受體LOX-1攝入oxLDL。

基于以上的研究數(shù)據(jù)，筆者認(rèn)為鉀通道Kv1.3不僅參與調(diào)節(jié)HUVECs LOX-1的表達(dá)水平，還因此調(diào)節(jié)HUVECs攝取oxLDL，該效應(yīng)的實(shí)現(xiàn)與p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。本研究為Kv1.3參與動(dòng)脈粥樣硬化形成增添了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也令人們更加相信粥樣斑塊形成與心律失常發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。