膠基型嚼煙中19種多環(huán)芳烴的氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)法測定

蔡潔云 王惠平 劉 巍 顧健龍孫浩巍 張 軻 龍 杰 李 超

(1. 云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650104；2. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650024)

膠基型嚼煙是一種通過咀嚼提供煙堿的新型煙草制品產(chǎn)品，是一種重要的無煙氣煙草制品[1]，主要含有4類成分：可咀嚼的天然樹膠和熱塑性樹脂等食用膠基、煙草(煙草提取物)、煙堿，以及香精香料、軟化劑、甜味劑等食品添加劑[2]。目前，對無煙氣煙草制品成分及其含量的檢測尚未形成相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，研究成果也有限。對無煙氣煙草制品成分的研究[3-5]主要側(cè)重于煙堿含量及其釋放行為，也有一些成果對揮發(fā)性香味物質(zhì)[6]、醛類物質(zhì)[7]、TSNAs[8-9]、多環(huán)芳烴類物質(zhì)[10]、多元醇類保潤劑[11]、重金屬元素[12]的檢測進(jìn)行了報(bào)道。

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一類分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、交狀或簇狀排列形成的稠環(huán)形芳香化合物，是難降解、易揮發(fā)的碳?xì)浠衔铮嗑咧掳┬訹13-14]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)[15-17]對卷煙中多環(huán)芳烴的動(dòng)物致癌試驗(yàn)表明，苯并[a]芘、苯并[k]熒蒽、苯并[g,h,i]芘和茚并[1,2,3-cd]芘等多環(huán)芳烴具有強(qiáng)致癌性；其中，苯并[a]芘致癌性最強(qiáng)，屬于一類致癌物質(zhì)，其在較低濃度下就有強(qiáng)致癌作用，可能誘發(fā)食管癌、胃癌，或經(jīng)空氣吸入誘發(fā)肺癌。近年的研究表明，無煙氣煙草制品的細(xì)胞毒性[18]和致癌性[19]小于傳統(tǒng)卷煙。最近的研究[20]證實(shí)，無煙氣煙草制品中含有多種多環(huán)芳烴。對無煙氣煙草制品中多環(huán)芳烴含量檢測鮮有研究，對膠基型嚼煙中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的含量檢測尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。多環(huán)芳烴檢測前處理過程通常需要固相萃取對樣品進(jìn)行凈化，操作繁瑣且耗時(shí)長。

試驗(yàn)擬采用串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，以目標(biāo)物的質(zhì)荷比為導(dǎo)向，建立一種簡便高效的測定膠基型嚼煙中19種多環(huán)芳烴(包括兩環(huán)芳烴2個(gè)、三環(huán)芳烴5個(gè)、四環(huán)芳烴4個(gè)、五環(huán)芳烴6個(gè)、六環(huán)芳烴2個(gè))含量的方法，以期為膠基型嚼煙質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠基型嚼煙樣品：6種市售進(jìn)口膠基型嚼煙樣品，試驗(yàn)前樣品密封儲(chǔ)存于冰箱中(-18 ℃)；

萘(NAP)、1-甲基萘(1-Me NAP)、苊烯(ANY)、苊(ANA)、芴(FLU)、菲(PHE)、蒽(ANT)、熒蒽(FLT)、芘(PYR)、苯并[a]蒽(BaA)、屈(CHR)、苯并[b]熒蒽(BbF)、苯并[k]熒蒽(BkF)、苯并[e]芘(BeP)、苯并[a]芘(BaP)、苝(PER)、茚并[1,2,3-cd]芘(IPY)、二苯并[a,h]蒽(DBA)、苯并[g,h,i]芘(BPE)、氘代萘(NAP-d8)、氘代蒽(ANT-d8)、氘代苯并[a]芘(BaP-d8)標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，美國Sigma-Aloaich公司；

環(huán)己烷：色譜純，美國Fisher Scientific公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：AG204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

振蕩器：MAXQ 2000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

氣相色譜—三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)：7890A/7000B型，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 樣品前處理

試驗(yàn)前，將待分析樣品在室溫下解凍2 h。解凍后，將樣品切塊、研磨粉碎后，過篩(顆粒直徑<4 mm)，準(zhǔn)確稱取1.00 g 樣品置于50 mL 錐形瓶中，加入含有氘代萘(320 ng/mL)、氘代蒽(320 ng/mL)和氘代苯并[a]芘(320 ng/mL)的環(huán)己烷溶液250 μL作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，再加入10 mL環(huán)己烷作為萃取劑；將錐形瓶在室溫下振蕩萃取40 min后，靜置5 min，將萃取液通過0.22 μm尼龍66濾膜，收集樣品于色譜瓶中，待GC-MS/MS分析。

1.4 GC-MS/MS檢測參數(shù)

色譜進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持7 min；以20 ℃/min升至100 ℃；以4 ℃/min升至290 ℃并保持20 min；傳輸線溫度：280 ℃；質(zhì)譜電離方式：EI；離子源溫度：280 ℃；質(zhì)譜掃描方式：動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dMRM)模式；碰撞氣：氮?dú)?，流?.5 mL/min；載氣：氦氣，流速2.25 mL/min。

以最高濃度的工作溶液為分析對象，通過全掃描模式(MS1 scan)選擇各目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)合適的母離子；在此基礎(chǔ)上，在5～60 eV的條件下，以5 eV為檢測間隔，采用產(chǎn)物離子掃描模式(product ionscan)進(jìn)行檢測，優(yōu)化碰撞能量，優(yōu)選產(chǎn)物離子[21]。待測化合物及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

1.5 結(jié)果的計(jì)算與表述

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中待測物的含量與內(nèi)標(biāo)量之比對色譜圖中待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)面積的比值作圖，得到工作曲線的a值和b值。樣品中的待測物含量按式(1)計(jì)算，取兩個(gè)平行樣品的算術(shù)平均值作為樣品的測試結(jié)果。含量以每克膠基型嚼煙中多環(huán)芳烴的質(zhì)量表示，單位為ng/g，結(jié)果精確到0.01 ng/g。

(1)

式中：

mi——膠基型嚼煙中多環(huán)芳烴物質(zhì)i的含量，ng/g；

Ai——萃取液中多環(huán)芳烴物質(zhì)i的峰面積；

a、b——由線性回歸方程求出；

Ms——樣品溶液中的內(nèi)標(biāo)含量，ng；

As——內(nèi)標(biāo)峰面積；

V——萃取液的體積，mL；

m——進(jìn)行試驗(yàn)分析的膠基型嚼煙，g。

取兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值作為樣品的最終測試結(jié)果，精確至0.01 ng/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS/MS檢測條件的選擇

無煙氣煙草制品中PAHs的含量范圍較廣，不同牌號產(chǎn)品中的PAHs含量差異很大，基質(zhì)復(fù)雜。為確保方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，對于19種PAHs都通過選定2個(gè)離子對(1個(gè)定性離子對和1個(gè)定量離子對)和相應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)來確保方法的準(zhǔn)確性，并且每個(gè)PAHs都選用相應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量，使得定量內(nèi)標(biāo)在保留時(shí)間和峰形上都能與定量離子保持較好的一致性(見表1)。

由于同環(huán)數(shù)的PAHs化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)類似，三環(huán)的菲和蒽，四環(huán)的熒蒽和芘，四環(huán)的苯并[a]蒽和屈，五環(huán)的苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[e]芘、苯并[a]芘和苝，六環(huán)的茚并[1,2,3-cd]芘和苯并[g,h,i]芘，上述5組分別為同分異構(gòu)體，需要選擇適宜的色譜條件，使每組同分異構(gòu)體中各化合物的色譜峰完全分離，才能準(zhǔn)確定量分析。最終優(yōu)化的色譜條件如1.3所述，在上述條件下，所有待測化合物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)都能很好的質(zhì)子化，色譜峰型均較好(見圖1)。

2.2 萃取時(shí)間的選擇

PAHs多易溶于環(huán)己烷，因此環(huán)己烷作為萃取試劑。

表1 化合物信息及質(zhì)譜分析參數(shù)

為選擇合適的萃取時(shí)間，按1.3所述前處理步驟，準(zhǔn)確稱取5份相同的樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL環(huán)己烷后，進(jìn)行常溫振蕩萃取，萃取時(shí)間分別為20，30，40，50，60 min。其檢測結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，萃取時(shí)間為20，30 min時(shí)，待測物并未完全溶解至萃取液中；當(dāng)萃取時(shí)間>40 min時(shí)，大部分待測物在萃取液中的含量趨于穩(wěn)定，小部分待測物在萃取液中的含量呈峰值狀態(tài)。因此，較優(yōu)的萃取時(shí)間為40 min。

2.3 方法學(xué)評價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系與檢出限、定量限 建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中，含萘、1-甲基萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[e]芘、苯并[a]芘、苝、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]芘的標(biāo)準(zhǔn)物及其內(nèi)標(biāo)氘代萘、氘代蒽和氘代苯并[a]芘，溶劑為環(huán)己烷。根據(jù)試驗(yàn)檢測所得膠基型嚼煙中多環(huán)芳烴的含量范圍，確定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度依次為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，200.0 ng/mL(標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各分析物的濃度相同)；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)濃度均為8 ng/mL。

將所配制的PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液由低到高濃度進(jìn)樣分析，以分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比(Y)對相應(yīng)的分析物濃度(X，ng/mL)進(jìn)行線性回歸分析，得到各分析物的工作曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。PAHs的線性范圍為0.5～200.0 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 7～0.999 9，表明在測定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 ng/mL)，平行測定10次，計(jì)算測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以3SD計(jì)算方法的檢出限[22]，分別為0.04～0.14 ng/mL；以10SD計(jì)算方法的定量限，分別為0.14～0.46 ng/mL，結(jié)果見表2。

圖1 GC-MS/MS法測定膠基型嚼煙中19種多環(huán)芳烴含量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖

圖2 萃取時(shí)間對膠基型嚼煙樣品檢測結(jié)果的影響

Figure 2 Effects of shake duration on the detection results of gum-based chewing tobacco

2.3.2 準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性 經(jīng)優(yōu)化條件，測定低、中、高3個(gè)添加水平的膠基型嚼煙樣品中19種多環(huán)芳烴，重復(fù)進(jìn)行6次加標(biāo)回收率試驗(yàn)，計(jì)算各物質(zhì)的回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在3種添加水平下，19種多環(huán)芳烴的加標(biāo)回收率分別為92.26%～109.10%，92.85%～109.46%，97.42%～106.17%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%～4.70%，表明該方法準(zhǔn)確性較高。

采用加標(biāo)樣品(中等濃度加標(biāo))進(jìn)行穩(wěn)定性的精密度考察，對各樣品分別進(jìn)行6次平行測定，根據(jù)結(jié)果分別計(jì)算各多環(huán)芳烴的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，日內(nèi)和日間RSD范圍分別為0.77%～3.85%，1.57%～4.86%，均<5%，說明所建方法重現(xiàn)性較好。

2.4 膠基型嚼煙樣品的PAHs含量測定

采用優(yōu)化分析方法，測定了6種膠基型嚼煙樣品中各種PAHs含量。檢測結(jié)果表明，樣品中多環(huán)芳烴均未檢出(n=2)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，從多環(huán)芳烴類物質(zhì)傳遞的角度而言，由于生產(chǎn)工藝和原料的影響，膠基型嚼煙的溶出物中一般不含有多環(huán)芳烴類物質(zhì)，屬于較為安全的無煙氣煙草制品。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種應(yīng)用氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS/MS)技術(shù)測定膠基型嚼煙中多環(huán)芳烴含量的方法，以內(nèi)標(biāo)法定量。該方法具有樣品前處理簡單快捷、試劑用量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且可以同時(shí)檢測膠基型嚼煙中19種多環(huán)芳烴物質(zhì)，能滿足膠基型嚼煙中多環(huán)芳烴簡單、快速、準(zhǔn)確檢測的要求。該方法還可推廣至含煙、鼻煙等其他類型的無煙氣煙草制品的檢測中。

表2 19種PAHs的工作曲線回歸方程、R2、檢出限和定量限

表3 GC-MS/MS法測定膠基型嚼煙中多環(huán)芳烴的加標(biāo)回收率和精密度?

? 低添加水平1 ng/mL，中添加水平20 ng/mL，高添加水平200 ng/mL。