單性木蘭枝多酚提取工藝及抗氧化性研究

鄭燕菲 張 強 藍亮美許建本 黃秋萍 林依娜

(1. 廣西民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣西 崇左 532200；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530022； 3. 柳州城市職業(yè)學(xué)院機電與汽車工程系，廣西 柳州 545036)

單性木蘭又名廣西木蘭，花單性、雄雌異株[1]。目前，單性木蘭的有效成分研究主要集中在揮發(fā)油、脂肪酸、多糖、多酚及其生物活性[2-4][5]63-90。黃品鮮等[3]采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對單性木蘭種皮的揮發(fā)組分中的油層精油和溶解在水中的化學(xué)成分分別進行了定性定量分析；課題組前期曾對單性木蘭的新鮮雄花、雌花、葉、果皮和果肉的揮發(fā)性成分進行了分析，并研究了單性木蘭葉多糖提取工藝及其抗腫瘤活性[4][5]15-37；還優(yōu)化了單性木蘭葉多酚的微波輔助提取工藝，最高提取率為(2.44±0.02)%，并評價得知單性木蘭葉多酚具有良好的抗氧化性[6]。但對單性木蘭枝中多酚的研究未見報道，若能將修剪丟棄的單性木蘭枝作為原料提取多酚類化合物，并將其應(yīng)用于開發(fā)保健藥品及功能食品，有利于擴大其應(yīng)用價值。植物多酚是具有抗氧化[7]、抗菌[8]、抗腫瘤[9-10]等活性的一種可再生綠色資源，其常見的提取方法有溶劑法、微波輔助法、超聲輔助法和酶解法等[11]，其中超聲輔助法因簡單易行、溶劑消耗少、提取率高等而被廣泛使用[12]。

為了全面構(gòu)建單性木蘭化學(xué)成分庫，完善開發(fā)單性木蘭的綜合利用，試驗擬以單性木蘭枝為原料，采用超聲波輔助法提取多酚，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計確定最佳提取工藝，并研究單性木蘭枝多酚的總抗氧化性、對DPPH·和·OH的清除作用，以期擴展單性木蘭該資源化學(xué)成分研究的數(shù)據(jù)資源以及為單性木蘭作為功能性食品、天然抗氧劑品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

單性木蘭枝：采摘于廣西南寧武鳴；

福林酚：分析純，上海寶曼生物科技有限公司；

丙酮：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

單寧酸、結(jié)晶紫：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

DPPH：分析純，阿拉丁工業(yè)公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗儀：KQ-300DB型，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；

分析天平：AR224CN型，上海奧豪斯儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：AOE型，翱藝儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 單性木蘭枝于50 ℃烘干，粉碎，過40目篩。以石油醚為溶劑，按4∶1 (mL/g)液固比，于70 ℃油浴回流4 h，趁熱抽濾，55 ℃烘干3 h，得單性木蘭枝脫脂原料，密封保存以備用。

1.2.2 單性木蘭枝多酚的定性分析 分別往單性木蘭枝多酚提取液中加入少量的0.3% FeCl3溶液、1%明膠溶液，搖勻，觀察試驗現(xiàn)象；向10 mL單性木蘭枝多酚提取液中依次加入1 mL 36%甲醛和2 mL濃鹽酸，煮沸，回流30 min，觀察試驗現(xiàn)象；取單性木蘭枝多酚提取液0.1 mL，進行Folin-Ciocalteaus顯色，用紫外分光光度計掃描[5]68。以單寧酸作為對照。

1.2.3 單性木蘭枝多酚的定量分析 以蒸餾水為溶劑，配制質(zhì)量濃度為105 μg/mL的單寧酸標準溶液，準確移取0.3，0.5，0.8，1.0，1.3 mL的單寧酸標準溶液于5個25 mL的棕色容量瓶中，加入1.3 mL的福林酚溶液，搖勻靜置6 min，加入5 mL的飽和碳酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，定容至刻度線，搖勻避光靜置30 min[13]。以單寧酸溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標，繪制出單寧酸的標準曲線，擬合回歸方程為：y=0.106 4x+0.090 7，R2=0.999 2。說明在1.00～6.00 μg/mL范圍內(nèi)，單寧酸呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

準確量取一定體積的樣品提取液，用上述方法顯色后測定吸光度，用標準曲線方程計算相關(guān)濃度，根據(jù)式(1)計算單性木蘭枝多酚的得率。

(1)

式中：

Y——單性木蘭枝多酚的得率，%；

WR——脫脂原料的質(zhì)量，g；

C——通過標準曲線方程求出的濃度，μg/mL；

V1——提取液的總體積，mL；

V2——測定時量取的提取液體積，mL。

1.2.4 單性木蘭枝多酚提取工藝優(yōu)化 稱取10.00 g單性木蘭枝脫脂原料，在溫度65 ℃下進行超聲輔助提取，研究不同提取劑、丙酮濃度、液固比、提取時間對單性木蘭枝多酚得率的影響。

(1) 提取劑：采用液固比20∶1 (mL/g)，提取時間為10 min，提取劑分別為70%丙酮，70%乙醇，70%乙醇(1%鹽酸)酸性溶液，蒸餾水，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(2) 丙酮濃度：采用液固比20∶1 (mL/g)，提取時間為10 min，丙酮溶度分別為50%，60%，70%，80%，90%，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(3) 液固比：采用丙酮濃度70%，提取時間為10 min，液固比分別為10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1 (mL/g)，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(4) 提取時間：采用丙酮濃度70%，液固比為20∶1 (mL/g)，提取時間分別為5，10，15，20，25 min，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(5) 響應(yīng)面優(yōu)化試驗：在單因素試驗后，對丙酮濃度、液固比、提取時間進行響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計試驗，以單性木蘭枝多酚得率為評價指標，優(yōu)化單性木蘭枝多酚提取工藝條件。

1.2.5 單性木蘭枝多酚的分離 將單性木蘭枝多酚提取液在40 ℃下減壓濃縮，于50 ℃烘干得多酚粗提物。將單性木蘭枝多酚提取液在40 ℃下減壓濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層和水層于50 ℃下濃縮干燥，分別得到乙酸乙酯層樣和水層樣。

1.2.6 單性木蘭枝多酚抗氧化性的測定 試驗取單性木蘭枝多酚粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣為研究對象，對其總抗氧化性、DPPH·清除能力和·OH清除能力進行抗氧化性測定。

(1) 總抗氧化性：分別取質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 mg/mL的單性木蘭枝多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣溶液各1 mL，依次加入0.6 mol/L濃硫酸1 mL、28 mmol/L磷酸鈉溶液1 mL、4 mmol/L鉬酸銨溶液1 mL，于95 ℃的水浴中恒溫1.5 h，在695 nm的波長下測定其吸光度[14]，用VC溶液作對照。試驗平行3次，取平均值。

(2) DPPH·清除作用：分別取質(zhì)量濃度為0.000 1，0.000 5，0.001 3，0.001 7，0.002 3，0.003 5，0.005 0 mg/mL的單性木蘭枝多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣溶液2 mL，分別加入0.004 mg/mL的DPPH·乙醇溶液2 mL，搖勻，避光放置0.5 h，在514 nm的波長下測定其吸光度Ai[5]71[15]，其中不加DPPH·乙醇溶液時的吸光度為Aj，在加入DPPH·乙醇溶液前用蒸餾水代替多酚樣品溶液作空白，測定吸光度A0，用VC溶液作對照。試驗平行3次，取平均值。按式(2)計算單性木蘭枝多酚對DPPH·的清除率。

(2)

式中：

S——多酚對DPPH·的清除率，%；

A0——水與DPPH·混合溶液的吸光度；

Ai——樣品溶液與DPPH·混合反應(yīng)后的吸光度；

Aj——樣品溶液與無水乙醇混合溶液的吸光度。

(3) ·OH清除作用：分別取質(zhì)量濃度為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 mg/mL的單性木蘭枝多酚的粗取物、乙酸乙酯層樣、水層樣溶液1 mL于10 mL刻度試管中，依次加入0.4 mmol/L結(jié)晶紫0.3 mL、1.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.2 mL、2.0 mmol/L過氧化氫溶液0.6 mL，用pH 4.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸的緩沖溶液定容到刻度線，混勻，避光靜置0.5 h，在580 nm的波長下測定其吸光度As[16]，其中不加過氧化氫溶液時的吸光度為A0，在加入過氧化氫溶液前用蒸餾水代替多酚樣品溶液作空白，測定吸光度Ab，用VC溶液作對照。試驗平行3次，取平均值。按式(3)計算單性木蘭枝多酚對·OH的清除率。

(3)

式中：

S——多酚對·OH的清除率，%；

A0——體系中不加過氧化氫溶液的吸光度；

As——加入樣品溶液的吸光度；

Ab——不加樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單性木蘭枝多酚的定性分析

2.1.1 顏色反應(yīng)對比 用單性木蘭枝的多酚提取液的顏色反應(yīng)進行定性分析，用單寧酸溶液作對比，結(jié)果如表1所示。由表1可知，單性木蘭枝的提取液中含有多酚類物質(zhì)——單寧。

2.1.2 紫外可見光譜分析 經(jīng)福林酚顯色，單性木蘭枝

表1 提取液和單寧酸的對比

多酚提取液和單寧酸標準品的紫外可見光譜如圖1所示。由圖1可知，單性木蘭枝多酚提取液和單寧酸標準品的最大吸收波長，均顯示在760 nm處，故選擇760 nm作為測定的吸收波長。

圖1 單性木蘭枝多酚的紫外可見光譜圖

Figure 1 UV spectra ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

圖2 提取劑對單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 2 Effect of different solvent on yieldM.kwangsiensisbranch polyphenols

2.2 單性木蘭枝多酚提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的影響 由圖2可知，提取劑對單性木蘭枝多酚得率影響的次序為：70%丙酮>70%乙醇>70%乙醇(1%鹽酸)酸性溶液>蒸餾水。根據(jù)相似相溶原理可知，丙酮溶液與多酚物質(zhì)的極性相近，確定丙酮溶液為單性木蘭枝多酚的最佳提取溶劑。

2.2.2 丙酮濃度的影響 由圖3可知，隨著丙酮濃度的增大，單性木蘭枝多酚的得率呈先增大后降低的趨勢，當丙酮濃度為70%時得率最高，原因可能是丙酮濃度過大，脂溶性物質(zhì)溶出增加，從而多酚得率降低[17]。故選擇60%，70%，80% 3個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2.3 液固比的影響 由圖4可知，隨著液固比的增大，單性木蘭枝多酚的得率呈先增大后趨于平緩的趨勢，在液固比>20∶1 (mL/g)時，單性木蘭枝多酚得率幾乎保持不變。適當增大液固比有利于多酚溶出，但液固比過大，會消耗大量溶劑、增大后續(xù)濃縮的操作難度[18]。故選擇15∶1，20∶1，25∶1 (mL/g)3個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2.4 提取時間的影響 由圖5可知，隨著提取時間的增加，單性木蘭枝多酚的得率呈先增大后減少的趨勢，當提取時間為15 min時得率最大，這是因為剛開始超聲輔助提取時，單性木蘭枝粉末細胞破碎度逐漸增加，但超聲提取時間過長時，多酚雖已基本溶出，但部分多酚已被氧化分解[19]。故選擇10，15，20 min 3個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖3 丙酮濃度對單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 3 Impact of acetone concentration on yield ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

圖4 液固比對單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 4 Impact of ratio of solvent to materials on yield ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

圖5 提取時間對單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 5 Impact of extraction time on yield ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

2.2.5 提取條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇丙酮濃度、液固比、提取時間3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。試驗選取的因素與水平見表2，試驗方案與結(jié)果見表3。

表2響應(yīng)面設(shè)計試驗的因素和水平表

Table 2 Independent variables and their levels in the response surface methodology test

水平X1 丙酮濃度/%X2 液固比(mL/g)X3 提取時間/min-16015∶11007020∶11518025∶120

表3響應(yīng)面設(shè)計試驗方案及結(jié)果

Table 3 The experimental design and results for yield of polyphenols in the response surface methodology test

序號X1X2X3多酚得率/%1-1-100.9321-100.953-1101.1841101.165-10-11.11610-11.247-1011.3181011.1190-1-11.161001-11.09110-111.05120111.39130001.46140001.47150001.40160001.38170001.40

對表3中的試驗結(jié)果進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，將各個數(shù)值與對應(yīng)的各因素之間的關(guān)系進行二元回歸擬合，可以得到單性木蘭枝多酚的得率(Y)對丙酮濃度(X1)、液固比(X2)、提取時間(X3)的回歸方程為：

Y=-11.86+0.270 8X1+0.280 4X2+0.107 2X3-0.000 2X1X2-0.001 7X1X3+0.004 1X2X3-0.001 7X12-0.007 7X22-0.002 3X32。

(4)

由回歸方程可知，對單性木蘭枝多酚得率影響的因素從大到小的順序為：液固比>丙酮濃度>提取時間。將單性木蘭枝多酚得率的二次多項回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸方程方差分析?

? * P<0.05，** P<0.01，*** P<0.000 1。

由表4可知，R2=0.972 3，失擬項不顯著，表明單性木蘭枝多酚得率的二次多項方程擬合較好，方程可靠性較強。在一次項X1、X2、X3中，僅X2的P值在0.001～0.010范圍內(nèi)，效果較為顯著，表明液固比對單性木蘭枝多酚的得率影響最強，丙酮濃度和提取時間影響較弱。在交互項X1X2、X1X3、X2X3中，丙酮濃度和提取時間、液固比和提取時間之間的交互作用對單性木蘭枝多酚的得率均有較強的影響。在二次項X12、X22、X32中，丙酮濃度和液固比的二次項比提取時間的二次項對單性木蘭枝多酚的得率影響較大。

2.2.6 響應(yīng)面圖和等高線圖分析 通過Design Expert 7.0軟件對響應(yīng)面的試驗結(jié)果進行擬合，研究丙酮濃度、液固比、提取時間這3個因素對單性木蘭枝多酚得率的影響相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線如圖6～8所示。由圖6～8可

知，對單性木蘭枝多酚得率影響較大的是丙酮濃度和提取時間、液固比和提取時間的交互作用，影響較小的是丙酮濃度和液固比的交互作用。

2.2.7 最優(yōu)條件的驗證 通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗得單性木蘭枝多酚最優(yōu)提取條件為：67.40%丙酮濃度、22.44∶1 (mL/g)液固比、19.64 min提取時間，預(yù)測單性木蘭枝多酚的得率為1.46%。綜合試驗條件，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為67%丙酮濃度、22∶1 (mL/g)液固比、20 min提取時間。在調(diào)整后的條件下平行提取4次，單性木蘭枝多酚的得率分別為1.46%，1.45%，1.45%，1.44%，平均得率為1.45%，與預(yù)測值的相對誤差為0.46%，證明該響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果可靠。有文獻[5]82[6]指出，單性木蘭葉中多酚的得率為2.44%，高于試驗單性木蘭枝多酚得率，可能是因為單性木蘭不同部位的多酚含量有所差別，或是因為不同提取條件對得率有影響。

圖6 丙酮濃度和液固比對多酚得率的3D和2D作用

圖7 丙酮濃度和提取時間對多酚得率的3D和2D作用

圖8 液固比和提取時間對多酚得率的3D和2D作用

2.3 單性木蘭枝多酚的抗氧化性

2.3.1 總抗氧化性 由圖9可知，所有樣品溶液的總抗氧化性均隨濃度的增大而增強。當濃度為0.07 mg/mL時，VC的吸光度為0.56，單性木蘭多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣的吸光度分別VC的40.71%，30.18%，41.07%。說明單性木蘭多酚具有一定的總抗氧化性，但弱于VC。

圖9 單性木蘭枝多酚的總抗氧化性能力

Figure 9 Total antioxidant activities ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

2.3.2 DPPH·清除作用 由圖10可知，單性木蘭枝多酚樣品對DPPH·清除能力與濃度呈正相關(guān)。當濃度為0.005 mg/mL時，單性木蘭枝多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣的清除率分別為90.22%，67.39%，82.61%。與VC的清除作用相比，單性木蘭枝多酚具有良好的DPPH·清除效果。

2.3.3 ·OH清除作用 由圖11可知，單性木蘭枝多酚樣品對·OH具有良好清除能力，清除能力與濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系。當濃度為0.40 mg/mL時，VC對·OH的清除率為36.43%，而單性木蘭枝多酚的清除作用均強于VC，粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣的清除率分別相當于VC的2.31，2.69，2.41倍。

圖10 單性木蘭枝多酚的DPPH·清除能力

Figure 10 Scavenging activities ofM.kwangsiensisbranch polyphenols on DPPH·

圖11 單性木蘭枝多酚的·OH清除能力

Figure 11 Scavenging effect ofM.kwangsiensisbranch polyphenols on ·OH

3 結(jié)論

試驗采用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化單性木蘭枝多酚超聲波輔助提取法提取工藝最優(yōu)條件：丙酮濃度67%，液固比22∶1 (mL/g)，提取時間20 min，該條件下，單性木蘭枝多酚得率達1.45%?？寡趸匝芯堪l(fā)現(xiàn)，單性木蘭枝多酚具有一定的總抗氧化性，但具有良好的DPPH·和·OH清除效果，說明單性木蘭枝多酚可開發(fā)作為食品、藥品、化妝品等行業(yè)的天然抗氧化物。試驗并未對單性木蘭枝多酚類物質(zhì)進行深入的純化分離，后續(xù)可采用大孔吸附樹脂進行分析純化，以及探究單性木蘭枝多酚抗氧性的量效關(guān)系。