基于皮克林乳液聚合四環(huán)素磁性分子印跡—生物炭微球的研制

馬珍珍 何金興 趙 濤 趙曉磊

(齊魯工業(yè)大學〔山東省科學院〕食品科學與工程學院，山東 濟南 250353)

四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines，TCs)是一類臨床應用較早的廣譜抗生素。由于TCs成本低且較易獲得，被廣泛應用于防治動物疾病和促進動物生長[1]，不合理的濫用導致TCs在動物源性食品中殘留嚴重，對人體健康和環(huán)境具有潛在危害，如過敏反應[2]、抗藥性基因的出現(xiàn)和傳播[3]，增加患皮膚癌的風險[4]。GB 31650—2019中明確規(guī)定在禽蛋中TCs最大殘留限量為400 μg/kg，動物肌肉組織中為200 μg/kg，肝臟中為600 μg/kg，牛奶中為100 μg/kg。目前，針對TCs的定量分析方法包括色譜法[5]、熒光分析法[6]、免疫分析法[7]、微生物抑制法[8]和傳感器分析技術(shù)[9]等。其中，色譜法是最常用的檢測技術(shù)，該方法的測量準確度高、重現(xiàn)性好，但因食品基質(zhì)中干擾成分多且分析物豐度低，樣品前處理過程對檢測結(jié)果的準確性和靈敏度有很大影響。

生物炭作為一種新興吸附材料，已被證實可用于去除環(huán)境中氯霉素和四環(huán)素(TC)污染[10-11]。生物炭來源廣泛、價格低廉、制備簡單，具備豐富的多孔結(jié)構(gòu)且易于修飾[12]，在食品樣品前處理領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。但實際應用中，生物炭缺乏特異性的劣勢給食品中痕量目標物的識別帶來了難度。分子印跡技術(shù)是模擬抗體—抗原的識別過程，制備高特異性的聚合物材料的方法，常規(guī)的分子印跡材料的制備方法包括本體聚合、原位聚合和表面印跡等[13]。皮克林乳液是以固定顆粒作為穩(wěn)定劑形成兩相或多相體系，由于固體顆粒在水相和在油相的親潤性不同，能夠穩(wěn)定吸附在兩相界面上阻止液滴的碰撞和合并[14-15]。利用皮克林乳液聚合法制備生物炭印跡聚合物，通過兩相界面上印跡方法，可以改善生物炭在常規(guī)溶劑中分散性差并解決常規(guī)方法合成過程中生物炭可能團聚導致印跡位點分布不均的問題。

試驗擬以生物炭作為皮克林乳液穩(wěn)定劑，制備新型水包油型皮克林乳液。以TC為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、二乙烯基苯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，四氧化三鐵(Fe3O4)與生物炭作為共穩(wěn)定劑，制備磁響應四環(huán)素印跡生物炭微球(MMIPMs)。并以此聚合物為磁性固相萃取材料，與高效液相色譜儀(HPLC)離線聯(lián)用，建立適用于動物源性食品中TCs痕量殘留檢測的方法。旨在為生物炭在食品中痕量污染物檢測方面的應用提供一種新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

TC：98%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

鹽酸土霉素(OTC)、鹽酸強力霉素(DC)：98%，上海源葉生物科技有限公司；

磺胺二甲基嘧啶(SMZ，99%)、甲基丙烯酸：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

速滅威(TMC，99.2%)、偶氮二異丁腈：天津市科密歐化學試劑有限公司；

二乙烯基苯：80%，上海易恩化學技術(shù)有限公司；

生物炭：400～450 ℃熱解的稻殼生物炭，沈陽卡力瑪生物炭科技開發(fā)有限公司；

魚和雞肉樣品：市售，用均質(zhì)機均質(zhì)后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器設備

HPLC：1260 Infinity II型，美國Agilent Technologies公司；

掃描電子顯微鏡：EM-30plus型，韓國COXEM公司；

X射線衍射儀：D8-Advance型，德國Bruker公司；

熱重分析儀：TGA-1型，瑞士Mettler公司；

傅里葉紅外光譜儀：Nicolet 6700型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

紫外可見分光光度計：TU1901型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 二乙烯基苯純化 取200 mg的堿性氧化鋁裝填在固相萃取小柱中，取3 mL的二乙烯基苯混合物過柱，去除阻聚劑，將純化后的二乙烯基苯低溫避光儲存。

1.2.2 生物炭表面改性 首先研磨稻殼生物炭，過70目篩。取20.0 g生物炭溶于200 mL氫氧化鈉溶液(3 mol/L)中，在60 ℃下攪拌2 h。用G5砂芯漏斗分離得到的堿性處理的生物炭顆粒，用乙醇和蒸餾水洗滌，直到洗脫液呈中性。隨后將堿性處理后的生物炭在-0.1 MPa和60 ℃下真空干燥8 h，干燥避光保存。

1.2.3 四氧化三鐵的制備 將1.99 g FeCl2·4H2O和3.24 g FeCl3溶于100 mL蒸餾水中。配制50 mL 2 mol/L的NaOH溶液，80 ℃水浴加熱，之后在攪拌狀態(tài)下逐滴加入5 mL鐵離子溶液，繼續(xù)劇烈攪拌30 min。通過外加磁場分離收集產(chǎn)物，用蒸餾水洗滌至pH為中性，然后將制備的產(chǎn)物Fe3O4在真空中干燥。

1.2.4 皮克林乳液聚合法制備MMIPMs 以生物炭和Fe3O4作為皮克林乳液共穩(wěn)定劑，形成水包油型乳液體系，其中水相為蒸餾水，油相為甲苯。取90 mg生物炭和30 mg Fe3O4，將其分散在12 mL蒸餾水中，超聲處理10 min。取1 454 μL甲苯置于離心管中，加入200 μL 48 mg/mL的TC甲醇溶液、64 μL甲基丙烯酸、278 μL二乙烯基苯、30 mg偶氮二異丁腈，混勻作為油相。然后將油相與水相混合，手動搖晃3 min，直至形成穩(wěn)定的皮克林乳液，60 ℃水浴下反應5 h。聚合反應結(jié)束后，將乳液倒入G5砂芯漏斗中抽濾，用甲醇洗滌3次，除去殘留的低聚物和單體。利用甲醇—乙酸(體積比9∶1)洗滌，去除模板分子TC，真空干燥得到最終的MMIPMs。

非印跡材料(MNIPMs)的合成除不加模板分子TC外與上述印跡材料合成方法一致。

1.2.5 材料的表征

(1) 掃描電鏡：將合成的材料粘在導電膠上噴金處理通過掃描電鏡觀察微球形貌。

(2) 紅外光譜：干燥的待測樣品與干燥的溴化鉀按1∶100的比例混合，于研缽中研磨壓片，用傅里葉變換紅外光譜進行分析測試。

(3) X射線衍射：在2θ為10°～90°范圍內(nèi)對Fe3O4和MMIPMs的晶型結(jié)構(gòu)進行表征。

(4) 熱重分析：以10 ℃/min的加熱速率，在45～600 ℃范圍內(nèi)檢測材料的熱穩(wěn)定性。

1.2.6 材料的吸附性能

(1) 吸附動力學試驗：稱取10 mg MMIPMs/MNIPMs材料，分別加入5 mL 20 mg/L的TC甲醇溶液，分散于棕色容量瓶中。放置于搖床上振蕩，通過磁分離取振蕩不同時間后(5，10，20，40，60，120，240 min)的樣品上清液。通過紫外分光光度計測定上清液吸光度，并按式(1)計算吸附容量。

(1)

式中：

Q——吸附容量，mg/g；

Ci——溶液中模板分子吸附前的濃度，mg/L；

Cf——溶液中模板分子吸附后的濃度，mg/L；

V——樣品溶液的體積，L；

m——合成材料的質(zhì)量，g。

(2) 等溫吸附性能評價：稱取10 mg MMIPMs/MNIPMs置于棕色容量瓶中，分別加入5 mL不同濃度(5，10，20，40，60，80 mg/L)TC溶液。振蕩一段時間后，通過磁分離手段取上清液。通過紫外分光光度計測定上清液吸光度，并按式(1)計算吸附容量。

(3) 選擇吸附試驗：TC和OTC作為結(jié)構(gòu)類似對照組，SMZ和TMC作為參比化合物對照組，進行選擇性試驗。首先，稱取10 mg MMIPMs和MNIPMs加入到棕色容量瓶中，配置濃度為40 mg/L不同物質(zhì)的甲醇標準溶液，分別取5 mL上述溶液加入到容量瓶中。放置在搖床上，室溫下振蕩混合物一段時間后，用外加磁場分離混合物，上清液通過尼龍66膜(0.22 μm)過濾。用紫外分光光度計分別檢測4種分析物的濃度，按式(1)計算吸附容量，根據(jù)式(2)～(3)計算分配系數(shù)、選擇性系數(shù)和相對選擇性系數(shù)。

(2)

(3)

(4)

式中：

Kd——分配系數(shù)；

K——選擇性系數(shù)；

K’——相對選擇性系數(shù)。

1.2.7 固相萃取與HPLC聯(lián)用

(1) 樣品處理：5.0 g雞肉/魚肉樣品，加入5 mL Na2EDTA-MCIlvaine緩沖液，冰水浴中超聲處理20 min，然后8 000 r/min離心10 min，重復操作兩次，合并兩次上清液。水樣取5 mL。

(2) 磁性固相萃取程序：稱取20.0 g MMIPMs，加入上述樣品提取液，振蕩提取2 h，通過外加磁鐵分離，丟棄上清液。用3 mL超純水—甲酸(體積比80∶20)洗脫20 min，磁分離取上清液，過0.22 μm濾膜，然后用HPLC進行測定。

(3) HPLC條件：色譜柱為Xterra C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相為含30%甲醇的乙腈溶液—0.01 mol/L檸檬酸溶液(體積比21∶79)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；檢測波長357 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)表征

圖1(a)表明，通過皮克林乳液聚合法合成的MMIPMs為球形結(jié)構(gòu)，生物炭和Fe3O4分散附著在球體表面。通過對合成的MMIPMs和MNIPMs進行傅里葉紅外光譜分析，驗證磁性生物炭微球的成功制備。如圖1(b)所示，3 448 cm-1處為生物炭分子間氫鍵O—H的伸縮振動，2 927 cm-1處為生物炭中脂肪烴或環(huán)烷烴中C—H的伸縮振動，1 737 cm-1處為甲基丙烯酸的C═O吸收峰，1 603～1 447 cm-1的4個強度不等的峰為二乙烯基苯的苯環(huán)C═C骨架振動，575 cm-1為Fe—O的吸收峰，上述結(jié)果表明成功合成了MMIPMs。通過X射線衍射儀進一步分析所制備的Fe3O4和MMIPMs的磁特性，如圖1(c)所示，合成的Fe3O4在2θ(30.24°，35.59°，43.25°，57.29°，62.88°)處有衍射峰，分別為(220)、(311)、(400)、(511)和(440)面的特征衍射峰，與反尖晶石型的Fe3O4標準衍射譜的特征衍射圖吻合較好(JCPDS card, No. 19-0629)。此外，MMIPMs的衍射圖譜與Fe3O4的峰位相似，表明在MMIPMs合成過程中Fe3O4的結(jié)晶結(jié)構(gòu)得到了很好的保持，因此合成的MMIPMs具有Fe3O4超順磁性，可以應用于磁分離。通過熱重分析儀對MMIPMs的熱穩(wěn)定性進行了分析，結(jié)果如圖1(d)所示。在溫度達到380 ℃之前，材料基本無質(zhì)量損失；380～458 ℃有明顯的失重(60%)，在此階段主要是由于聚合物基本解體，主體骨架坍塌由MMIPMs的熱降解所致，剩余的組分為生物炭和Fe3O4粒子。以上結(jié)果表明，通過皮克林乳液聚合法，只需要簡單地將Fe3O4作為共穩(wěn)定劑，便成功制備了形狀規(guī)則的MMIPMs，而且合成的材料具有很好的熱穩(wěn)定性。

2.2 材料的吸附性能評價

2.2.1 吸附動力學 吸附動力學是評價印跡材料吸附效率的重要指標。如圖2(a)所示，MMIPMs和MNIPMs對TC的吸附速率呈先增加后減小的趨勢，在吸附初始階段聚合物表面暴露足夠多的結(jié)合位點，而隨著吸附的進行，大多數(shù)結(jié)合位點被TC占據(jù)，導致后續(xù)吸附過程中的空間阻力較大，吸附速率下降。另外，聚合物在吸附30 min內(nèi)就可達到最大吸附量的50%，吸附60 min后吸附量呈現(xiàn)極緩慢的增長，直至120 min后吸附達到平衡，吸附平衡時間短，是因為生物炭的多孔結(jié)構(gòu)提高了傳質(zhì)速率。在實際應用過程中，快的傳質(zhì)速率有利于增強前處理過程中的萃取效率。

2.2.2 等溫吸附曲線 如圖2(b)所示，MMIPMs和MNIPMs

圖1 聚合物的掃描電鏡、傅里葉紅外光譜、X射線衍射和熱重分析表征

Figure 1 Characterizations of polymers by scanning electron microscope, fourier transform infrared spectrometer,

X-ray diffractometer and thermogravimetric analysis

圖2 MMIPMs和MNIPMs的吸附動力學曲線以及吸附等溫線

的吸附量隨初始濃度的增加而增加。與MNIPMs相比，MMIPMs明顯具有更高的吸附能力，當非印跡材料達到吸附飽和時，印跡材料吸附量仍呈上升趨勢。當溶液初始濃度為80 mg/L時，印跡材料和非印跡材料的吸附量分別為11.68，3.08 mg/g，印跡因子為3.79，說明MMIPMs具有較好的印跡效果。

2.2.3 選擇性試驗 由表1可知，MMIPMs對TC的吸附量明顯高于對其他分析物(OTC、SMZ、TMC)的吸附量，且高于MNIPMs的吸附量。MMIPMs對TC的吸附量(11.1 mg/g)是對SMZ吸附量(0.353 mg/g)的31.4倍，表明制備的MMIPMs對模板分子TC表現(xiàn)出良好的選擇性。用選擇性系數(shù)K進一步評價MMIPMs和MNIPMs的吸附選擇性。顯然，對于4種參比物質(zhì)，MMIPMs的選擇性系數(shù)均大于MNIPMs，且MMIPMs和MNIPMs的相對選擇性系數(shù)K’>1，進一步證實了MMIPMs對TCs的良好特異性識別能力。

表1 MMIPMs和MNIPMs對4種分析物的選擇性

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

為了得到最佳的萃取效果，對試驗過程中可能影響萃取效率的因素進行優(yōu)化，包括洗脫溶劑的種類、洗脫劑體積和洗脫時間，結(jié)果見圖3。選用不同種類的洗脫液(10%～20%甲酸乙腈溶液、5%～20%甲酸水溶液)對吸附后的MMIPMs淋洗，如圖3(a)所示，當洗脫液為20%的甲酸水溶液時，獲得的回收率最高(82.4%～85.8%)，因此選用20%的甲酸水溶液洗脫。選用不同體積(2～5 mL)的20%甲酸水溶液進行洗脫，如圖3(b)顯示洗脫劑體積為3 mL時，3種TCs的回收率就能達到94.8%～104.0%。圖3(c)為不同洗脫時間(10～60 min)下的回收率情況，當洗脫時間為20 min時，回收率為97.0%～100.0%)，隨著洗脫時間的增大，回收率沒有明顯的增長，因此選用20 min為洗脫時間。

根據(jù)優(yōu)化試驗結(jié)果，用3 mL含20%甲酸的水溶液作為洗脫劑，洗脫20 min進行后續(xù)研究。

2.4 實際樣品中的應用

以合成的MMIPMs作為磁性固相萃取吸附材料，結(jié)合HPLC建立了一種適用于食品中TCs獸藥殘留的檢測方法。在最佳萃取條件下，當TCs濃度為5～160 μg/L時，目標物濃度與峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.997 2)，選取信噪比(S/N)為3時的溶液濃度為TCs的最低檢測限，TC和OTC儀器檢測限分別為1.42，1.58 μg/L，方法檢出限分別為0.46，0.51 μg/L。

為進一步證明所建方法的可行性，對魚肉、雞肉和水樣品進行3個濃度水平加標(5，10，20 μg/kg)，通過得到的加標回收率評價所建立方法的準確度。由表2可知，加標魚肉、雞肉、水樣中的回收率分別為91.2%～103.4%，90.6%～98.9%，92.0%～101.4%，RSD為1.23%～9.99%，該結(jié)果滿足GB/T 27404—2008定量分析檢測要求(被測組分含量<0.1 mg/kg，回收率范圍為60%～120%)，與其他方法(表3)比較，試驗方法具有較高的回收率和較低的檢出限，說明該方法可用于食品中TCs殘留定量分析。

3 結(jié)論

以生物炭和四氧化三鐵作為皮克林乳液的共穩(wěn)定劑，結(jié)合分子印跡技術(shù)，合成了一種新型磁響應四環(huán)素印跡生物炭微球。該方法制備過程簡單、成本低、合成的聚合物為具有磁響應特性的規(guī)整球形結(jié)構(gòu)，可以簡化樣品前處理的提取和凈化環(huán)節(jié)。吸附性能研究表明得到的磁響應四環(huán)素印跡生物炭微球傳質(zhì)速率較快(120 min基本達到吸附平衡)、吸附量較大(11.68 mg/g)、對目標物具有良好的選擇性(印跡因子為3.79)。以高效液相色譜儀作為分析儀器，所建立的檢測方法實現(xiàn)了對食品中四環(huán)素類抗生素的準確分析(3種樣品的回收率為90.6%～103.4%，RSD為1.23%～9.99%)。為生物炭在食品樣品中污染物檢測方面的應用提供了一條新的思路和方法。

圖3 不同萃取條件對回收率的影響

表2 不同樣品中3種TCs的加標回收率及精密度

Table 2 The recoveries and RSDs of three TCs in different spiked samples (n=3)

TCs濃度/(μg·L-1)分析物 魚肉/% 雞肉/% 自來水/% 回收率RSD回收率RSD回收率RSD5OTC96.15.3598.24.94101.46.42TC103.43.8091.86.2892.01.2310OTC100.4 6.2598.95.88 95.71.56TC94.64.4392.53.7194.75.9920OTC91.21.3096.61.98 95.29.99TC97.11.7290.64.9593.65.51

表3 與其他文獻方法的比較?

? a 單位為μg/L；b 單位為μg/kg。