鮮食水稻籽粒成熟過程中多糖組成及抗氧化活性分析

李洪亮 李 丹 張 超 張東杰

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

水稻中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、脂類物質(zhì)等[1]。鮮食水稻指在乳熟期至成熟期之間收獲、利用的水稻，此時水稻籽粒營養(yǎng)素含量與活性最佳，這時采收可以提升水稻的利用價值[3]。

2013年，中國的行業(yè)專家創(chuàng)造性地提出了基于“全谷物”的“鮮食全谷物”的新概念?！磅r食全谷物”是通過對谷物整粒加工進(jìn)行徹底和即時的冷凍，不需經(jīng)過破碎、研磨等加工處理，可極大程度保留稻谷天然營養(yǎng)物質(zhì)和功能成分。但中國開發(fā)鮮食全谷物新產(chǎn)品發(fā)展進(jìn)程緩慢，僅局限于傳統(tǒng)意義上的鮮食產(chǎn)品例如玉米和豆類。目前有關(guān)于水稻鮮食的報道還很少。

近幾年各類谷物多糖功效被報道，玉米多糖具有減肥降脂，降血糖，提升免疫力，抗衰老作用等功效[3-4]；大豆多糖對自由基有明顯的清除效果，具有抗腫瘤作用，并可以調(diào)節(jié)血糖、血脂、改善腸道活性、促進(jìn)營養(yǎng)元素吸收等[5-6]；大麥多糖具有降血糖活性，對羥基自由基有良好的清除效果[7]。與稻米有關(guān)的多糖研究表明，糙米發(fā)芽后多糖、米糠多糖均具有較好的抗氧化活性[8-9]；水稻灌漿后16～24 d所含生物活性物質(zhì)最為豐富[10]，但其中發(fā)揮重要作用的組分有待深入研究。試驗擬以不同成熟時期的鮮食水稻籽粒為原料，探索鮮食水稻籽粒中多糖的單糖組成與抗氧化能力，為鮮食水稻的加工利用提供參考，并為開發(fā)新型水稻產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鮮食水稻：型號龍粳-31，分別采集乳熟(前、中、后)期、蠟熟期與完熟期的水稻樣品，采收地點為黑龍江省鶴崗寶泉嶺名山農(nóng)場；

無水乙醇、苯酚：分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；

硫酸、正丁醇、三氯甲烷：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

過硫酸鉀、硫酸亞鐵、抗壞血酸：分析純，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、乙腈、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、三氟乙酸：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；

單糖標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖)：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超聲—微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀：CW-2000型，上海新拓分析儀器科技有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260 LC型，安捷倫科技有限公司；

電子天平：AR323CN型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

紫外可見分光光度計：TU-1810PC型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 鮮食水稻籽粒多糖提取 參考超聲—微波協(xié)同萃取法[11]，并稍加修改。將鮮食水稻經(jīng)60 ℃烘干至恒重，脫殼，粉碎，過100目篩得鮮食水稻干粉，鮮食水稻干粉石油醚回流除脂，以料液比1∶10 (g/mL)加入蒸餾水，在超聲波功率50 W，微波功率600 W，溫度65 ℃條件下超聲—微波萃取30 min，3 200 r/min離心15 min，重復(fù)提取2次合并上清液。通過Molish試驗檢測所提物成分[12]，酶法除淀粉，用4倍體積無水乙醇在4 ℃下沉淀12 h，3 200 r/min離心15 min，蒸餾水溶解沉淀，Sevage法除蛋白質(zhì)，膜法除去小分子物質(zhì)[13-14]，冷凍干燥12 h，得鮮食水稻籽粒多糖粉。

1.2.2 鮮食水稻籽粒多糖測定

(1) 配制6%苯酚溶液：稱取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，常壓蒸餾，收集(180±2) ℃餾分。精密稱取該餾分6 g于100 mL容量瓶中，再加入94 g蒸餾水，搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液，將其置于冰箱中備用[15]。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg溶解于100 mL容量瓶中。搖勻配制成1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液置于25 mL具塞比色管中，各加蒸餾水至2 mL，分別加入6%苯酚試劑1 mL，搖勻后立刻加入濃硫酸5 mL，立刻搖勻后靜置30 min。于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[16-17]。

(3) 鮮食水稻籽粒多糖測定：將提取的樣品稀釋后按照1.2.2(2)的方法進(jìn)行測定，得到所提樣液含糖量。

1.2.3 鮮食水稻籽粒多糖分子組成測定 取20 mg鮮食水稻籽粒多糖樣品于10 mL具塞試管中，加1 mL蒸餾水溶解多糖，加入4 mol/L三氟乙酸1 mL，密封，在110 ℃條件下水解5 h，冷卻后，用甲醇蒸餾4 次，除去多余的酸，蒸干后取2 mg干物質(zhì)，溶解于0.3 mol/L NaOH溶液(200 μL)中，加入0.5 mol/L PMP—甲醇溶液200 μL，混勻，70 ℃條件下反應(yīng)1 h，加入0.3 mol/L HCl溶液(200 μL)，混勻，加入1 mL氯仿，用力振搖，4 000 r/min離心5 min，棄掉氯仿層[18-19]，將上清液過0.22 μm微孔濾膜過濾，取10 μL濾液準(zhǔn)備上樣。參照馬麗萍[20]的方法，稍作修改，使用1260型高效液相色譜儀，其中HPLC條件為：C18柱；柱溫30 ℃；流動相A為pH 6.7的KH2PO4—Na2HPO4溶液(83%)，流動相B為乙腈(17%)；DAD檢測器，波長245 nm。

1.2.4 鮮食水稻籽粒多糖抗氧化能力測定

(1) ABTS+自由基清除能力：使用2.45 mmol/L K4S2O8溶液配制2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS+)溶液，得到7 mmol/L ABTS+儲備液，將儲備液在室溫、避光條件下放置16 h，取適量儲備液，用pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)緩沖液稀釋至734 nm波長下OD值為0.70±0.02，作為ABTS+工作液。將樣品稀釋得到不同濃度梯度待測液，取0.5 mL樣品，加入3.5 mL ABTS+工作液，均勻混合，避光反應(yīng)20 min后在734 nm波長下測定吸光度[21]。根據(jù)式(1)計算得到ABTS+自由基清除率。

(1)

式中：

R——清除率，%；

A0——空白組吸光度值；

A1——樣品吸光度值；

A2——對照組吸光度值。

(2) DPPH自由基清除能力：用無水乙醇配制0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液于棕色容量瓶中，避光保存。將稀釋成不同濃度梯度的樣品分別取2 mL于試管中，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，避光條件下反應(yīng)30 min，于517 nm波長下測定吸光度[22]。根據(jù)式(1)計算DPPH自由基清除率。

(3) 羥基自由基清除能力：分別配制質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL鮮食水稻籽粒多糖溶液置于不同燒杯中，然后分別加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL并啟動整個反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測量各濃度的吸光度[23]。根據(jù)式(1)計算羥基自由基清除率。

(4) 超氧陰離子清除能力：取50 mmol/L Tris-HCl 溶液(pH 8.2)3 mL于10 mL具塞試管中，分別加入0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL樣品2 mL，混勻，在25 ℃水浴條件下反應(yīng)10 min，加入提前在等溫度下預(yù)熱的30 mmol/L鄰苯三酚溶液200 μL，混勻后反應(yīng)4 min，加入0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在320 nm處測量吸光度[24]。根據(jù)式(1)計算超氧陰離子清除率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS分析軟件進(jìn)行處理，差異顯著性P<0.05表示有差異統(tǒng)計學(xué)意義。各組數(shù)據(jù)平均值(Mean)均采用：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，作為最終參考比較值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮食水稻籽粒多糖含量

將在5個不同成熟階段采集的鮮食水稻樣品進(jìn)行測定，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的回歸方程y=0.284 5x-0.022 5(R2=0.998 9)得到各采集時間多糖含量以及變化規(guī)律如圖1所示。隨著成熟時間的延長，鮮食水稻籽粒中多糖含量呈先上升后下降的趨勢，其中乳熟后期多糖含量最多，達(dá)46.89 mg/g。水稻灌漿初期，籽粒中的多糖組分處于蓄積狀態(tài)，在乳熟后期多糖含量達(dá)到最大值，籽粒逐漸變堅硬，隨后多糖逐漸合成淀粉儲存于籽粒中，以至于多糖含量降低，成熟后多糖含量變化趨于平穩(wěn)。

圖1 不同采集時期鮮食水稻籽粒多糖含量

Figure 1 Polysaccharides content of immature rice seeds in different collecting periods

2.2 鮮食水稻籽粒多糖Molish試驗分析

糖在濃H2SO4或濃鹽酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與α-萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物。如圖2所示，添加淀粉的b管中幾乎無顏色變化，與空白相近，c～h管中均產(chǎn)生顏色反應(yīng)，結(jié)果表明通過超聲—微波協(xié)同萃取出的物質(zhì)確為非淀粉多糖。

a. 水 b. 淀粉 c. 葡萄糖 d～h. 分別為乳熟前期、乳熟中期、乳熟后期、臘熟期及完熟期鮮食水稻提取出的多糖

圖2 Molish法鑒別鮮食水稻籽粒多糖

Figure 2 Identification of fresh edible rice seeds polysaccharides by Molish method

2.3 鮮食水稻籽粒多糖結(jié)構(gòu)組成

由圖3可知，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間分別為12.495，17.224，18.114，20.827，25.390，28.977，30.627，31.835，36.943 min。將不同濃度單糖對照品測定后進(jìn)行分析得到回歸方程如表1所示。

由表1可以看出，各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線均有較好的擬合度。根據(jù)各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出不同時期的鮮食水稻籽粒中多糖所含的各單糖含量，單糖含量如表2所示。

從表2可以得出，鮮食水稻籽粒中的多糖，均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖，但在蠟熟期、完熟期這兩個時期的鮮食水稻提取出的多糖中，未檢測出甘露糖和巖藻糖，其原因可能是水稻在成熟后期甘露糖和巖藻糖不能穩(wěn)定的存留在籽粒內(nèi)部導(dǎo)致的。隨著鮮食水稻籽粒逐漸成熟，半乳糖含量呈下降趨勢，葡萄糖含量相對較多，且呈上升趨勢，說明葡萄糖為鮮食水稻籽粒中多糖的主要組成部分。

a. 甘露糖 b. 鼠李糖 c. 葡萄糖醛酸 d. 半乳糖醛酸 e. 葡萄糖 f. 半乳糖 g. 木糖 h. 阿拉伯糖 i. 巖藻糖

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

Figure 3 HPLC chromatogram of monosaccharide standard

2.4 鮮食水稻籽粒多糖抗氧化能力

2.4.1 ABTS+自由基清除能力 由圖4可知，鮮食水稻籽粒多糖對ABTS+自由基有一定清除能力，且呈明顯的濃度依賴性；當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時，乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖清除率最強(qiáng)，達(dá)86.18%，其活性已趨近于VC的活性，較其他時期存在顯著差異(P<0.05)?？梢娫谌槭旌笃邗r食水稻籽粒多糖清除ABTS+自由基能力更強(qiáng)。有研究[25-26]表明，小米糠多糖、燕麥多糖對ABTS+自由基清除率約為57.84%，50.62%，均低于試驗中乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖。

2.4.2 DPPH自由基清除能力 如圖5所示，在試驗濃度范圍內(nèi)，鮮食水稻籽粒多糖對DPPH都有一定的清除作用，其清除效果與多糖濃度呈正相關(guān)。在測定范圍內(nèi)濃度為1 mg/mL時，對DPPH的清除率最高；乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖與其他4個成熟階段的多糖存在差異顯著(P<0.05)。雖然與VC相比還存在一定差異，但是與相關(guān)研究中大豆多糖(19.19%)[27]、納豆多糖(18.33%)[28]相比還存在一定優(yōu)勢。

表1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 鮮食水稻籽粒多糖的單糖百分含量?

? ND為未檢出；與完熟期相比較，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖4 不同成熟時期鮮食水稻中多糖的ABTS+自由基

Figure 4 ABTS+radical scavenging ability of polysaccharides in immature rice at different developing stages

2.4.3 羥基自由基清除能力 如圖6所示，乳熟后期鮮食水稻籽粒清除能力均比同一濃度下不同生長階段的鮮食水稻籽粒多糖的清除能力高，達(dá)75.62%。說明鮮食水稻籽粒在乳熟后期至蠟熟期的生長階段，其羥自由基清除能力更強(qiáng)。

2.4.4 超氧陰離子清除能力 從圖7可以看出，VC和鮮食水稻籽粒多糖對超氧陰離子都有一定的清除能力；其中乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖對超氧陰離子的清除率最高，達(dá)41.49%，但仍略遜色于VC的清除能力。有研究[29]表明，粳米蛋白肽對超氧陰離子的清除能力為42.00%，與試驗結(jié)果相似。說明試驗所獲原料同樣具有清除超氧陰離子的能力。

圖5 不同成熟時期多糖的DPPH自由基清除能力

Figure 5 DPPH radical scavenging ability of polysaccharides in immature rice seeds at different developing stages

圖6 不同成熟時期鮮食水稻籽粒多糖的羥基自由基清除能力

Figure 6 OH radical scavenging ability of polysaccharides on immature rice at different developing stages

圖7 不同成熟時期鮮食水稻籽粒多糖的超氧陰離子清除能力

Figure 7 Superoxide anion scavenging ability of polysaccharides in immature rice at different developing stages

3 結(jié)論

以不同成熟時期的鮮食水稻籽粒為原料，通過超聲—微波協(xié)同萃取技術(shù)，得到非淀粉多糖，進(jìn)一步研究了多糖的組成及抗氧化活性。試驗結(jié)果表明，乳熟后期，鮮食水稻中多糖的含量最高，達(dá)46.89 mg/g，而且其組分主要為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖等，而完熟期鮮食水稻的多糖組分中并未檢出甘露糖和巖藻糖；研究發(fā)現(xiàn)，乳熟后期的鮮食水稻籽粒多糖對ABTS+自由基、DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除率分別為86.18%，56.81%，75.62%，41.69%，均強(qiáng)于其他時期，但與VC相比仍顯遜色。