粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)抗氧化多肽研究

魏長浩 鄧澤元 范亞葦鄒新華 李 靜 李紅艷

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047； 2. 播恩生物技術股份有限公司，江西 贛州 341000)

研究[1]表明，從江西本土發(fā)酵豆渣食品中分離篩選得到的粗壯脈紋孢菌(Neurosporacrassa)具有較強的產(chǎn)酶能力，且孢子中富含類胡蘿卜素，利用粗壯脈紋孢菌對農(nóng)副產(chǎn)品進行固態(tài)發(fā)酵，可以很大限度地降低其抗營養(yǎng)因子含量。此外，利用粗壯脈紋孢菌的產(chǎn)酶體系，還可以分解農(nóng)副產(chǎn)品中的纖維和蛋白質(zhì)等，產(chǎn)生糖類、肽段以及氨基酸等生物活性物質(zhì)，提高農(nóng)副產(chǎn)品的營養(yǎng)價值[2-4]。

豆渣作為大豆加工的副產(chǎn)物，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，但口感不佳、豆腥味濃且易腐敗變質(zhì)等[5]。葉俊等[6]研究發(fā)現(xiàn)，利用粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣能有效降低豆渣中的粗纖維含量，并且發(fā)酵后的豆渣中粗蛋白、粗纖維、可溶性總糖等營養(yǎng)物質(zhì)含量均有顯著提高。Vong等[7]發(fā)現(xiàn)，利用解脂耶羅威亞酵母發(fā)酵豆渣不僅能提高豆渣的營養(yǎng)水平，還可生成谷氨酸鹽等鮮味物質(zhì)。Vidiany等[8]使用釀酒酵母對豆渣進行發(fā)酵能有效促進總酚含量的增加和異黃酮的生物轉(zhuǎn)化，提高了豆渣的抗氧化性能。因此，利用微生物發(fā)酵豆渣不僅可以將底物中大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，還可通過微生物自身的生理生化反應產(chǎn)生新的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，提高豆渣的營養(yǎng)價值和保健功能。

試驗擬在粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣的最佳產(chǎn)蛋白酶條件下，對不同發(fā)酵時間的豆渣多肽、總酚、總黃酮含量和抗氧化性進行研究，為粗壯脈紋孢菌發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)物生產(chǎn)抗氧化肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種及原材料

粗壯脈紋孢菌CGMCC NO.3088：實驗室保藏；

豆渣：市售；

沒食子酸、蘆丁、谷胱甘肽(還原型)標準品：阿拉丁試劑(上海)有限公司；

DPPH標準品、FRAP試劑盒(BC1315)：上海索萊寶生物科技有限公司；

福林酚：分析純，上海索萊寶生科技有限公司；

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；

6×上樣緩沖液：北京全式金生物技術有限公司；

鄰苯三酚標準品：美國Sigma公司；

硫酸亞鐵、硫酸銅、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：分析純，西隴科學股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

恒溫恒濕箱：HPX-160BSH型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

電熱鼓風干燥器：DGG-9140A型，上海精宏實驗設備有限公司；

電子天平：FA1104型，上海精天電子儀器廠；

桌上型超凈工作臺：HD-650型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

全自動酶標儀：ELX800型，美國 BioTek 公司；

pH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 斜面培養(yǎng) 將粗壯脈紋孢菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)的固體斜面上，于30 ℃，濕度70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，光照條件下培養(yǎng)96 h，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 將活化好的菌種轉(zhuǎn)移到PDA固體培養(yǎng)基中，于30 ℃，濕度70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，光照條件下培養(yǎng)96 h，收集孢子制成孢子懸液。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵豆渣 稱取10 g豆渣為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基質(zhì)物質(zhì)，參照于新穎[9]的方法進行固態(tài)發(fā)酵108 h，每間隔12 h取樣，將樣品凍干并粉碎備用。

1.2.4 SDS-PAGE電泳 稱取樣品0.05 g，加入1 mL水，渦旋混勻，4 ℃，10 000 r/min離心5 min，取上清液，并與6×上樣緩沖液按比例混合，沸水浴10 min，冷卻，取15 μL樣液進行上樣。濃縮膠電泳輸出電壓80 V，分離膠電泳輸出電壓120 V。按表1的方法配置濃縮膠與分離膠。

表1 SDS-PAGE電泳制膠組成成分

1.2.5 多肽含量的測定 參照涂宗財?shù)萚10-11]的方法并修改。準確稱取不同發(fā)酵時間的凍干豆渣樣品1 g，加入10 mL蒸餾水，渦旋提取，4 500 r/min離心10 min，取1 mL上清液與1 mL 10%三氯乙酸混合，充分搖勻后靜置1～2 min，4 500 r/min離心10 min。取1.5 mL上清液并加入1.5 mL 5%三氯乙酸和2 mL雙縮脲試劑，充分混勻后靜置反應10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，測定540 nm處吸光值，以3 mL 5%的三氯乙酸與2 mL雙縮脲混合溶液為空白對照，按式(1)計算多肽含量。

(1)

式中：

C——多肽含量，mg/g；

X——查標準曲線值，mg/mL；

V——提取所用蒸餾水體積，mL；

W——提取所用樣品質(zhì)量，g；

N——提取液稀釋倍數(shù)。

1.2.6 多肽提取液的制備 參照陳潔梅等[12]的方法提取豆渣水溶性蛋白，并過0.45 μm微孔濾膜去除不溶物和細菌，4 ℃冷藏備用。

1.2.7 總酚含量的測定 采用福林酚試劑法[13]并修改。取一定量的發(fā)酵豆渣提取液，凍干后用等量的70%乙醇復溶，4 500 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入2 mL 0.2 mol/L福林酚溶液，混勻后靜置5 min，再加入3 mL 10%的碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25 mL，避光反應60 min，測定760 nm處吸光值，按式(2)計算總酚含量。

(2)

式中：

C——活性物質(zhì)含量，mg/g；

X——查標準曲線值，mg/mL；

V——提取所用蒸餾水體積，mL；

W——提取所用樣品質(zhì)量，g。

1.2.8 總黃酮含量的測定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法[14]并修改。取一定量的發(fā)酵豆渣提取液，凍干后用等量的70%乙醇復溶，4 500 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入0.4 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，混勻后靜置6 min，再加入0.4 mL 10%的硝酸鋁溶液，用70%乙醇定容至10 mL，避光反應15 min，測定510 nm處吸光值，按式(2)計算總黃酮含量。

1.2.9 總抗氧化能力的測定 參照FRAP試劑盒說明書，通過測定鐵離子還原能力評價不同發(fā)酵時間豆渣的總抗氧化能力。按式(3)計算總抗氧化能力。

(3)

式中：

C——總抗氧化能力，μmol/g；

X——硫酸亞鐵濃度，μmol/mL；

V1——提取所用蒸餾水體積，mL；

W——提取所用樣品質(zhì)量，g；

V2——反應液總體積，μL；

V3——反應中樣品體積，μL。

1.2.10 超氧陰離子自由基清除率的測定 參照文獻[15]。

1.2.11 DPPH自由基清除率的測定 參照Torres-Fuentes等[16]的方法并修改。取2 mL樣品溶液，加入等量的95%乙醇溶液(含0.2 mmol/L DPPH)，混勻；以95%的乙醇與DPPH混合溶液為空白組；95%的乙醇溶液代替DPPH與樣品混合為對照組，避光反應30 min，測定517 nm處吸光值，按式(4)計算DPPH自由基清除率。

(4)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%；

As——樣品吸光值；

Ab——空白組吸光值；

Ac——對照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2017軟件制圖，用SPSS 19軟件進行顯著性(P<0.05)及相關性分析，結(jié)果以(平均值±標準差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳

由圖1可知，發(fā)酵后的豆渣存在許多原料豆渣中沒有的蛋白條帶，說明這些蛋白是粗壯脈紋孢菌菌體為滿足自身代謝需求所合成的。隨著發(fā)酵時間的延長，11 kDa左右的條帶顏色逐步加深，說明粗壯脈紋孢菌可以通過自身酶系生成小分子物質(zhì)，并逐漸積累。劉慧菊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物發(fā)酵處理脫脂蠶豆能有效提高原料中粗蛋白、可溶性蛋白以及多肽含量。

M. 標準蛋白 1. 豆渣原料 2. 發(fā)酵12 h 3. 發(fā)酵24 h 4. 發(fā)酵36 h 5. 發(fā)酵48 h 6. 發(fā)酵60 h 7. 發(fā)酵72 h 8. 發(fā)酵84 h9. 發(fā)酵96 h 10. 發(fā)酵108 h

圖1 發(fā)酵不同時間豆渣的SDS-PAGE圖

Figure 1 SDS-PAGE profiles of soybean dregs at different fermentation time

2.2 豆渣的多肽含量

由圖2可知，經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵的豆渣多肽含量與未經(jīng)發(fā)酵的豆渣存在顯著性差異(P<0.05)，且隨發(fā)酵時間的增加而上升。當發(fā)酵時間為84 h時，豆渣中多肽含量達最大，為(75.602±3.599) mg/g，是未發(fā)酵豆渣的5倍，說明利用粗壯脈紋孢菌發(fā)酵處理豆渣能很好地降解豆渣中的大分子蛋白并將其轉(zhuǎn)化為小分子多肽。孫林等[18]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的菜籽粕多肽含量是未經(jīng)發(fā)酵的7倍左右。發(fā)酵84 h后多肽含量出現(xiàn)下降，可能是因為繼續(xù)發(fā)酵會產(chǎn)生一些能降解肽的酶類[19]。

2.3 豆渣的總酚、總黃酮含量

由圖3可知，經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵的豆渣總酚、總黃酮含量與未經(jīng)發(fā)酵的豆渣存在顯著性差異(P<0.05)。當發(fā)酵時間為60 h時，豆渣中總酚、總黃酮含量達最大，分別為(2.513±0.032)，(0.787±0.052) mg/g，是未發(fā)酵豆渣的13，15倍。宋瑩等[20]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過發(fā)酵的紫薯生粉其總酚和總黃酮含量均有顯著提高。這可能是由于微生物發(fā)酵使得結(jié)合型酚類物質(zhì)與黃酮物質(zhì)被釋放，使得游離酚類化合物與黃酮類化合物含量顯著提高[14,21]。研究[22]表明，微生物可通過自身酶系合成黃酮類物質(zhì)或者改善合成途徑的方式提高基質(zhì)中的黃酮含量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Peptide contents of soybean dregs at different fermentation time

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 豆渣的抗氧化能力及其相關性

由圖4可知，經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵的豆渣總抗氧化能力、超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均顯著高于未經(jīng)發(fā)酵的豆渣(P<0.05)，三者的最高值均出現(xiàn)在發(fā)酵84 h時，分別為(31.651±0.191) μmol/g，(35.537±1.408)%，(70.131±0.552)%，說明發(fā)酵可以很好地提高底物的抗氧化活性。Lee等[23]研究發(fā)現(xiàn)，凍融豆腐在發(fā)酵18 h時最理想，其還原糖、總肽、異黃酮含量、抗氧化活性均有較大提高。

由表2可知，總酚、總黃酮以及多肽含量均與抗氧化能力極顯著相關(P<0.01)?？偪寡趸芰虳PPH自由基清除能力中，相關性最高的為多肽含量，其次是總酚含量；超氧陰離子自由基清除能力中總酚含量的相關性最高，其次是多肽含量。Moayedi等[24]研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸和多肽的濃度與抗氧化和抗菌活性之間呈良好的相關性。綜上，多肽含量的升高是抗氧化能力提升的關鍵因素，粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣會產(chǎn)生抗氧化多肽，且最佳發(fā)酵時間為84 h。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

表2發(fā)酵豆渣中多肽、總酚及總黃酮含量與抗氧化能力的相關性?

Table 2 Correlation between the content of peptides,total phenols,total flavone and antioxidant capacity of fermented soybean dregs

指標多肽含量總酚含量總黃酮含量總抗氧化能力超氧陰離子自由基清除能力DPPH自由基清除能力多肽含量1.000總酚含量0.952**1.000總黃酮含量0.762**0.846**1.000總抗氧化能力0.947**0.938**0.794**1.000超氧陰離子自由基清除能力0.963**0.974**0.817**0.976**1.000DPPH自由基清除能力0.969**0.956**0.787**0.991**0.989**1.000

? **表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

以粗壯脈紋孢菌作為發(fā)酵菌種，對其固態(tài)發(fā)酵豆渣抗氧化性質(zhì)進行了探索。結(jié)果表明，利用粗壯脈紋孢菌對豆渣進行發(fā)酵可以很好地利用豆渣中的大分子蛋白，并將其降解為多肽，發(fā)酵過程中可釋放處于結(jié)合狀態(tài)的多酚、黃酮等活性物質(zhì)，提高豆渣的利用價值。多肽含量與抗氧化能力最為相關，且當發(fā)酵時間為84 h時，多肽含量、總抗氧化能力、超氧陰離子自由基清除率、DPPH自由基清除率均達最高。試驗僅對多肽混合液進行了研究，后續(xù)將在此基礎上通過對抗氧化肽的分離純化以及鑒定對抗氧化肽進行深入研究。