冠狀病毒的病原學特征與宿主免疫功能調控的研究進展

張典 ?；?王曉曉 李春霞 程靜 張立志 張雅青

冠狀病毒(Coronaviruses，CoVs)是一類具有廣泛天然宿主的正鏈RNA病毒。在過去的幾十年中，新進化的CoVs已對全球公共衛(wèi)生構成嚴重威脅[1]。在CoVs感染期間，宿主的免疫系統(tǒng)會對病毒感染觸發(fā)免疫反應。免疫反應對于控制和消除CoVs感染至關重要，免疫調節(jié)機制異?？梢鹈庖叻磻Э?，導致肺組織細胞損傷及肺功能受損。了解CoVs和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用，可以明確肺組織炎癥反應的嚴重程度，揭示肺部炎癥反應的演變和發(fā)展方向[2]。本文對CoVs的病原學特征及宿主免疫系統(tǒng)在CoVs感染期間的調控機制予以綜述。

CoVs的病原學特征

近年來，在世界各地多次出現CoVs相關性感染，例如，2002年由CoVs引發(fā)的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS-COV)，2012年CoVs引發(fā)的中東呼吸綜合征(MERS-COV)，2019年底和2020上半年多個國家和地區(qū)報告的人類新型冠狀病毒感染(COVID-19)。流行病學表明，突發(fā)冠狀病毒感染傳播可能帶來災難性后果，對人類健康和經濟社會發(fā)展構成嚴重威脅[3]。

CoVs是有包膜非節(jié)段的正義單鏈RNA病毒，電子顯微鏡下可觀察到表面有許多規(guī)律排列的顆粒狀突起，病毒直徑約80～120nm，基因組包含2700～3200個堿基，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒[4]。CoVs病毒體由基因組RNA和膜蛋白組成，膜蛋白包含三種不同類型的糖蛋白，即刺突糖蛋白(Spike Protein，S)、小包膜糖蛋白(Envelope Protein，E)和膜糖蛋白(Membrane Protein，M)，某些種類還有血凝素糖蛋白(Haemaglutinin-esterase，HE)。病毒糖蛋白含有受體結合位點、主要抗原表位，具有對營養(yǎng)物質的跨膜運輸、新生病毒出芽釋放、形成病毒外包膜等作用。CoVs分為四個基因型，即α、β、γ和δ亞型。α-CoVs和β-CoVs是人類常見的病原體，30%～60%的中國人群血清抗CoVs抗體呈陽性反應。β-冠狀病毒又可以進一步分為四個病毒譜系，即A～D。目前已知感染人的CoVs共有7種，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1在人群中較為常見，一般致病性較低，可引起呼吸道感染癥狀，類似普通感冒；另外三種是MERS-CoV、SARS-CoV和COVID-19，傳染性及致病性強，嚴重病例可導致肺炎、嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡[5]。除感染人類外，CoVs還可感染蝙蝠、老鼠、貂、駱駝、刺猬等多種哺乳動物以及多種鳥類。CoVs對熱敏感，溫度達35℃則可抑制病毒生長。紫外線、來蘇水、0.1%過氧乙酸等消毒液可在短時間內將病毒殺死。

CoVs感染與宿主先天免疫應答

病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)是病原微生物表面特異存在的，由多種病原微生物所共享，結構恒定且進化保守的分子結構。PAMP是病原體賴以生存，變化較少的主要部分，使病原體很難產生突變而逃脫固有免疫的作用。非甲基化寡核苷酸CpG DNA、單鏈RNA、雙鏈RNA均為病毒相關的PAMP。宿主先天免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別CoVs。已知的PRR主要包括toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、RIG-1樣受體(RIG-I-like receptor，RLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptor，NLRs)、C型凝集素樣受體(C-type lectin-like receptor，CLR)等。與干擾素(Interferons，IFN)產生有關的PRRs主要包括TLRs、RLRs和NLRs[9]。

研究發(fā)現，TLRs識別CoVs的病毒核酸，通過激活不同的銜接蛋白(如MyD88，TIRAP，TRIP和TRAM)誘導不同的生物學反應。MyD88是第一個被鑒定的Toll/白細胞介素-I受體(TIR)家族成員，主要激活轉錄因子NF-kB和絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)途徑，以誘導炎癥因子的表達[10]。與MyD88不同，TRIF是TLR3和TLR4的銜接蛋白，可激活轉錄因子IRF3和NF-kB誘導I型干擾素和免疫炎癥因子的表達。TRAM和TIRAP的功能是將TRIF分子募集到TLR4受體，并將MyD88募集到TLR2和TLR4受體。MyD88依賴性通路可激活免疫炎癥因子，而TRIF依賴性通路可激活I型干擾素和炎癥性細胞因子。通過相應的PAMP激活TLR后，MyD88募集busy-1受體相關的激酶IRAK4、IRAKI、IRAK2和IRAK-M。IRAK4在激活MyD88下游的NF-kB和MAPK中起重要作用。IRAK與TRAF6相互作用，導致K-63泛素化，進一步促進NEMO泛素化以激活NF-kB、IRF3和干擾素β[11]。

RLRs包括H家族成員RIG-1(DDX58)，MDA5(IFIH)和LGP2，主要識別CoVs病毒核酸。RNA具有DExD / H-box RNA解旋酶結構和C末端終止結構(CTD)，而RIG-1和MDA5具有N末端半胱天冬酶募集結構，可與下游銜接子MAVS相互作用。C端RNA解旋酶和CTD結構可以識別RNA，其構象變化需要ATP才能使CARD結構與MAVS相互作用。病毒RNA的共同特征是具有三磷酸結構的短雙鏈，互補末端和/或富含聚U/UC的結構。RIG-I可以識別5'端含有三磷酸RNA的病毒核衣殼蛋白。當CTD結構識別出病毒的5'端三磷酸時，引起ATP依賴的構象變化，使CTD結構形成雙鏈RNA復合物，然后CARD結構從自我抑制中釋放出來并與MAVS相互作用[12]。NLRs是另一類模式識別受體，其識別CoVs病毒成分中包含保守的NOD結構。NLRs受體家族成員根據不同功能劃分為三類。第一類與多種蛋白質形成復合物，這些復合物包含至少八個NLR蛋白的炎癥小體，包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRC4、NLRC5W和AY2 等。第二類對于生殖和胚胎再生至關重要。第三類由調節(jié)性NLR組成。這些NLRs是陽性或陰性條件性炎癥信號傳導級聯(lián)的重要途徑。NLRs對CoVs的識別作用機制尚不明確[13]。

CLR是一類可溶性跨膜模式識別受體，在髓樣細胞中廣泛表達。由于其在細胞內區(qū)域具有多種信號傳導途徑的基序結構，CLR受體具有廣泛的生物學功能，包括細胞粘附、組織修復、血小板活化和自然免疫反應等。細胞中CLR主要由巨噬細胞誘導的Mincle和CLEC4E受體直接激活，以及受體細胞內HAM樣基序來激活受體，涉及募集酸化的脾酪氨酸激酶，進而促進CARD9、B細胞淋巴樣組織10和Maltl復合物的形成。同時，凋亡相關顆粒樣蛋白，被SyK和JNK酸化后，激活了下游分子，包括NF-kB和MAPKs，并引發(fā)多種細胞反應，包括細胞吞噬、DC細胞成熟和細胞趨化性等[14]。

研究發(fā)現，CoVs入侵宿主時，PRR最初會識別病毒核酸，收集特定的信號銜接蛋白，激活IFN3和IRF7，然后再轉移至細胞核并促進IFN-I合成。IFN-I激活下游JAK-STAT信號通路，促進IFN刺激因子ISG的表達。作為宿主的主要抗病毒分子，IFN可抑制病毒復制和傳播，發(fā)揮免疫調節(jié)作用，以促進抗原的巨噬細胞吞噬作用，以及NK細胞對受感染靶細胞和T/B細胞的抑制作用。PRRs中TLRs、RLRs和NLRs與IFN產生有關，IFN異常可直接影響病毒在宿主體內增值[15]。另外，血漿樹突狀細胞激活后，TLR7/ TLR9識別病毒核酸，以誘導由NF-κB和IRF7介導的炎性細胞因子和IFN-I的產生。樹突狀細胞在先天性免疫和適應性免疫應答中起關鍵作用。作為生物體中最強的抗原呈遞細胞，成熟的樹突狀細胞可以有效激活T細胞，在免疫應答的啟動、調節(jié)和維持發(fā)揮中心作用[16]。與健康對照組相比，COVID-19感染患者初始血漿IL-1β、IL-1Rα、IL-7、IFNγ、TNF-α等細胞因子和血管內皮生長因子濃度更高。重癥COVID-19患者的血漿IL-2、IL-7、IL-10和TNF-α的水平顯著高于輕癥患者。因此，免疫病理學在不同嚴重程度的COVID-19感染中發(fā)揮了重要作用[17]。另有研究發(fā)現，SARS-CoV編碼一種核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白，N蛋白可以抑制poly(I：C)或仙臺病毒誘導的IFN-β生成。然而，N蛋白不能抑制TLR3和RIG-I依賴途徑信號分子過表達誘導的IFN-β產生。研究認為，SARS-CoV的N蛋白可作為免疫逃逸蛋白，N蛋白的C末端結構域對IFN誘導產生拮抗作用，使SARS-CoV保持高致病性，影響宿主的先天性免疫應答的效果[18]。

CoVs感染與適應性免疫反應

B細胞亞群具有天然記憶細胞和抗體分泌細胞的表型特征，可在CoVs中大量聚集。使用特異性的9-mer肽CYSSLILDY，檢測到針對MERS-CoV的抗原結合位點，位于S糖蛋白區(qū)域內的437～445位點。該序列具有最強的B細胞抗原性，在計算機模擬中與MHC I類等位基因的相互作用最大[23]。研究顯示，體液免疫對于控制持續(xù)的CoVs感染至關重要，從MERS-CoV感染康復的患者分離出多種抗體，包括MCA1、CDC-C2、MERS-GD27和MERS-GD33等。研究發(fā)現，CoVs患者體內的抗體反應涉及復雜的單克隆抗體混合物，可作用于病毒包膜糖蛋白上的不同抗原結構域。已經發(fā)現了20多種人類抗體或人源化單克隆抗體，在針對MERS-CoV感染的適應性免疫反應中發(fā)揮作用。此外，MERS-CoV利用S蛋白作為粘附因子，通過二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)受體進入宿主細胞。DPP4是信號傳遞以及獲得性和先天性免疫應答激活的關鍵受體，針對DPP-4的靶向單克隆抗體可能具有與疫苗相似的保護作用[24]。

有學者發(fā)現，由噬菌體源制備的人單克隆抗體m336，可與MESS-CoV病毒刺突蛋白的受體結合區(qū)相互作用，體外實驗顯示對MES-CoV具有較強的中和活性，抗體m336可使肺組織中病毒RNA滴度降低40000～90000倍[25]。用MERS-CoV感染模型猴后，分別用高滴度超免疫血漿或單克隆抗體m336進行處理，兩組的臨床癥狀均可得到明顯緩解，但僅在超免疫血漿組中發(fā)現呼吸道病毒載量降低。研究表明，抗體m336可顯著降低兔肺組織中的病毒RNA滴度和與病毒相關的病理變化。但兩種療法均未能完全阻斷MERS-CoV感染，不同模型動物對MERS-CoV感染引起適應性免疫反應存在差異，MERS-CoV 感染可能存在種屬特異性[26]。此外，接種S納米顆粒的小鼠產生了針對同源病毒的高水平中和抗體，該抗體與異種病毒無交叉保護作用[27]。在受到SARS-CoV感染后，免疫雪貂比對照組產生更快更強的中和抗體反應，在肝組織中也觀察到強烈的炎癥反應[28]。研究顯示，SARS-CoV 的S蛋白與肝組織的炎癥反應增強有關。也有學者研究了SARS-CoV病毒血癥和抗體應答的時間分布。在SARS患者病毒血癥的高峰期，診斷前1-2周血液樣本中75%可以檢測到病毒RNA，但均未在恢復期患者的血液樣本中檢測到。研究認為，在SARS-CoV急性期的體液免疫反應和疾病恢復過程中，持續(xù)存在的IgG抗體對于控制病毒血癥及清除病毒具有重要意義[29]。

綜上所述，CoVs引起宿主的免疫系統(tǒng)產生先天和適應性免疫反應，適度的免疫反應對于抗CoVs感染至關重要，免疫調節(jié)機制異?？稍斐擅庖叻磻Ш饧鞍衅鞴俚慕Y構和功能損傷。明確CoVs與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，了解CoVs逃避先天性免疫系統(tǒng)的途徑，選擇應用CoVs靶向單克隆抗體，將為完善CoVs感染的抗病毒策略及改善預后提供依據。盡管COVID-19感染的流行時間較短，但傳播速度快，擴散范圍廣，感染人數及死亡人數多，可能與COVID-19 獨特的病原學特征有關，需要更多的臨床與基礎研究予以明確。