熒光PCR溶解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物突變的臨床應(yīng)用價值

鄒遠(yuǎn)嫵 王婷 李王平

中國是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，低治愈率、高死亡率是耐藥結(jié)核病的治療難點。WHO將氟喹諾酮類藥物列為A類核心藥物，用于治療耐多藥結(jié)核病[1]，在我國因該類藥物較易獲得，故被廣泛應(yīng)用。導(dǎo)致近年來該藥耐藥率逐漸上升?？煽康乃幬锩舾行栽囼?drug sensitivity test,DST)結(jié)果是耐藥結(jié)核病實施化學(xué)治療的基礎(chǔ)[2]。耐藥結(jié)核病的診斷主要依靠細(xì)菌耐藥表型檢測和基因型檢測，表型檢測法可靠性和可重復(fù)性較好[3]，但其或檢測周期長，或費用高。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，以及近年來對結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐藥機制的深入研究，通過檢測MTB耐藥基因突變快速診斷耐藥結(jié)核病成為可能。國內(nèi)大多文獻(xiàn)只報道MTB對一線抗結(jié)核藥物突變的檢測，對二線抗結(jié)核藥物耐藥突變研究多因病例少，代表性差[4]。本研究應(yīng)用溶解曲線法檢測MTB臨床分離株對二線抗結(jié)核藥物氟喹諾酮類藥物的耐藥突變，以評價溶解曲線法在耐藥結(jié)核病診治中的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、菌株來源

收集本實驗室經(jīng)臨床患者痰液分枝桿菌液體培養(yǎng)陽性并鑒定為MTB臨床分離株555株，同時進(jìn)行熒光 PCR 溶解曲線法和羅氏藥物敏感試驗檢測其對氟喹諾酮類藥物耐藥情況，以羅氏藥敏法為金標(biāo)準(zhǔn)，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

二、檢測方法

1、分離培養(yǎng)，儀器及配套試劑和MGIT培養(yǎng)管均來自美國BD公司，臨床標(biāo)本按要求進(jìn)行前處理后接種到MGIT培養(yǎng)管，并將其放入Bactec MGIT 960 分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行孵育。

2、抗酸染色，將上述培養(yǎng)陽性液體按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]要求進(jìn)行涂片抗酸染色鏡檢(采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司萋尼氏染色液)。

3、結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定，采用杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑卡對抗酸染色陽性的培養(yǎng)液進(jìn)行菌種鑒定。

4、羅氏藥物敏感試驗，將鑒定為結(jié)核分枝桿菌陽性的培養(yǎng)液按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]要求，接種于含有左氧氟沙星、莫西沙星藥物的羅氏藥敏培養(yǎng)管進(jìn)行藥物敏感性實驗(購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；結(jié)果判斷：固體培養(yǎng)耐藥百分比大于1%判為耐藥。

5、溶解曲線法檢測氟喹諾酮類藥物耐藥突變基因，將上述結(jié)核分枝桿菌陽性培養(yǎng)液作為樣本，按照廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類耐藥突變檢測試劑盒操作要求提取TB DNA加入反應(yīng)管后，利用上海宏石生物科技有限公司生產(chǎn)的熒光定量PC儀進(jìn)行擴增和溶解曲線分析；結(jié)果判斷：樣品的 Tm 值與陽性對照的Tm值一致即為野生型；樣品的 Tm 值低于陽性對照 2℃或以上即為突變型。

三、統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS15.0建立數(shù)據(jù)庫，采用卡方檢驗對兩種檢測方法結(jié)果耐藥性進(jìn)行比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以傳統(tǒng)羅氏藥敏法為金標(biāo)準(zhǔn),計算溶解曲線法的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、約登指數(shù)、符合率。

結(jié) 果

一、兩種方法檢測結(jié)果

兩種方法檢測555例臨床分離株耐藥情況。傳統(tǒng)藥敏法檢測41株對LFX耐藥，耐藥率為7.39%，32株對MFX耐藥，耐藥率為5.77%；其中41株耐LFX的分離株中有32株同時MFX耐藥,9株對MFX敏感。溶解曲線法檢測有68株為氟喹諾酮突變株，耐藥率為12.25%(68/555)。

二、溶解曲線法與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果比較

表1 溶解曲線法檢測左氧氟沙星耐藥突變與傳統(tǒng)方法比較

表2 溶解曲線法檢測莫西沙星耐藥突變與傳統(tǒng)方法比較

3 溶解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測效能

以羅氏藥敏法為標(biāo)準(zhǔn)，溶解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌左氧氟沙星、莫西沙星耐藥突變的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、約登指數(shù)、符合率(見表3)。

表3 溶解曲線技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測效能

討 論

化學(xué)療法是結(jié)核病最重要的治療手段[6]。WHO《耐多藥和耐利福平結(jié)核病治療指南》2018年更新版中將莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、貝達(dá)喹啉作為A類核心藥物[1]，氟喹諾酮類藥物中莫西沙星在治療廣泛耐藥結(jié)核病時不僅作為首選藥物，還需要全程使用[3]。

表型藥敏檢測是傳統(tǒng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因MTB緩慢生長特性造成該類實驗耗費時間過長，不利于疾病的早期診斷和治療，因此會造成耐多藥結(jié)核(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)傳播和延遲對患者的治療[7]。實時熒光PCR 溶解曲線法與傳統(tǒng)表型方法相比具有較高的一致性[4,8-9]本研究顯示熒光 PCR 溶解曲線法與羅氏藥敏法對二線抗結(jié)核藥物中左氧氟沙星和莫西沙星的檢測結(jié)果一致性高，與文獻(xiàn)所述一致。該實驗用時3小時，使耐藥結(jié)核病快速診斷、治療成為可能，從而減少傳染源也避免了因經(jīng)驗療法給患者和社會造成的損失。

本研究中羅氏藥敏法測試耐藥而溶解曲線法未檢測到耐藥突變一共有11株?？赡苡袃煞矫嬖颍?.研究發(fā)現(xiàn)MTB對氟喹諾酮類藥物的耐藥基因及突變位點75%～94%為gyrA基因的67～106位密碼子，5%～15%為gyrB基因的突變，本研究只檢測了檢測突變率極高的gyrA88位、90位、91位、94位突變，所以只能檢測到這幾個主要耐藥基因型，而未能檢測到罕見基因型突變；2.有可能患者為異質(zhì)性耐藥，即同時分離出敏感菌株和耐藥菌株的現(xiàn)象，傳統(tǒng)法可陽性檢出僅含1%耐藥菌株的標(biāo)本，而分子方法可能難以檢出[10]。在今后工作中應(yīng)運用多種檢測手段相結(jié)合，借助基因測序檢測方法證實上述可能。

溶解曲線法可用于耐藥結(jié)核的快速檢測，但在實際應(yīng)用中仍存在一些問題：1)目前本實驗只對臨床分離株進(jìn)行檢測，不適合臨床快速診斷需求。本實驗室正在嘗試直接用臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，減少臨床等待時間，實現(xiàn)快速診斷。2)溶解曲線法檢測兩種藥物的陽性預(yù)測值都很低，而陰性預(yù)測值很高，說明患者極有可能存在除左氧氟沙星和莫西沙星以外其他氟喹諾酮類藥物的耐藥突變。莫西沙星、左氧氟沙星在耐多藥結(jié)核病治療中有非常重要的作用[11]，故在臨床治療中應(yīng)結(jié)合臨床綜合考慮制定治療方案，不能以此作為放棄該類藥物的依據(jù)。另外，高耐藥的數(shù)據(jù)也提示我國應(yīng)對氟喹諾酮類藥物的使用進(jìn)行管控。減少由于藥物濫用引起的藥物敏感性降低。

綜上所述：傳統(tǒng)藥敏試驗雖然耗費時間長，但在臨床治療效果不佳時可作為調(diào)整方案的重要依據(jù)，在現(xiàn)階段臨床治療中仍有不可替代的作用。