非小細(xì)胞肺癌腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞特征及臨床意義

王新樂 袁飛 吳顯寧 徐美青

肺癌是目前全球范圍內(nèi)因癌癥相關(guān)死亡的主要原因?；颊呶迥晟媛始s為18%，晚期患者的生存率僅為3.9%，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的85%[1]。隨著各國學(xué)者們對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的不停探索，免疫治療已經(jīng)成為了非小細(xì)胞肺癌患者除手術(shù)、化療、放療及靶向治療之外的另一主流選擇，免疫治療使得治愈晚期腫瘤成為可能，甚至在逐步改變著局部晚期和早期可切除惡性腫瘤的臨床實(shí)踐[2-4]。機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定對(duì)于維持免疫耐受、抑制自身免疫反應(yīng)及防止免疫細(xì)胞過度增殖均具有重要的作用。

本研究旨在通過檢測(cè)NSCLC中各免疫細(xì)胞的表達(dá)水平,分析其在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的意義及其與臨床病理特征的相關(guān)性，為NSCLC的臨床診療提供參考依據(jù)。

材料和方法

一、臨床資料

收集2017年8月至2018年8月期間在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)接受手術(shù)治療的NSCLC(所有組織標(biāo)本病理類型全部經(jīng)過術(shù)后病理證實(shí))患者69例，其中包括男49例，女20例，年齡45～82(67.25±8.78)歲。病理類型含腺癌43例，鱗癌26例；病理分期Ⅰ/Ⅱ期48例， Ⅲ/Ⅳ期21例；腫瘤大小≦3cm患者36例，>3cm患者33例；術(shù)后病理證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者27例，陰性患者42例。其診斷均符合2015年WHO肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均為初次診斷并接受標(biāo)準(zhǔn)肺癌根治性手術(shù)；有完整臨床資料且術(shù)前均沒有接受過放療、化療等其他相關(guān)治療。

取69例患者的肺癌腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的距離腫瘤遠(yuǎn)端2cm以上的癌旁組織待測(cè)。

二、儀器和試劑

Attune NxT 流式細(xì)胞儀(美國ThermoFisher公司)。腫瘤消化儀、腫瘤消化試劑盒(貨號(hào)：130-095-929)均購自Milteny公司。紅細(xì)胞裂解液(貨號(hào)：R7757)購自Sigma公司。Fixable Viability Stain 780(死活染料，貨號(hào)： 565388)、Human BD Fc Block(Fc受體阻斷劑，貨號(hào)：564219)、Brilliant stain buffer(流式緩沖液，貨號(hào)： 563794)、Transcription Factor Buffer Set(轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白試劑，貨號(hào)：562574)均購自美國BD公司。

三、方法

1 標(biāo)本的處理 ① 對(duì)術(shù)中采集的標(biāo)本進(jìn)行稱重并記錄數(shù)據(jù)；②根據(jù)腫瘤消化試劑盒的說明書進(jìn)行操作，將標(biāo)本組織消化分解為單細(xì)胞懸液；將所得單細(xì)胞懸液用70 μm濾網(wǎng)過濾后洗滌，350×g離心10 min，棄上清；③加入紅細(xì)胞裂解液 (5 mL/克腫瘤)室溫裂紅3～5 min，用含血清培養(yǎng)基終止裂紅；加入PBS充分洗滌及離心，棄上清。

2 流式染色 ① 加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，記錄細(xì)胞密度與活力；②根據(jù)染色方案，每孔轉(zhuǎn)移1×106個(gè)細(xì)胞入96孔V底板；③加入PBS充分洗滌及離心，棄上清。④死活染料FVS780用PBS 1 ∶1 000稀釋后每孔加入100 μL，室溫避光放置10～15 min；加入PBS充分洗滌2次，4°C 350×g離心5 min，棄上清；⑤Fc受體阻斷劑用流式緩沖液1 ∶200稀釋后每孔加入100 μL，4 ℃避光孵育20 min；加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清。⑥每孔100 μL加入對(duì)應(yīng)的抗體混合物進(jìn)行細(xì)胞膜染，4 ℃避光孵育40 min；加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清；⑦根據(jù)染色方案，需要核內(nèi)染色的樣品孔用轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白試劑進(jìn)行固定、破膜與染色。加入破膜緩沖液充分洗滌及離心，棄上清。最后加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清；⑧細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，4 ℃避光孵育30 min；加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清；⑨每孔細(xì)胞加入200 μL流式緩沖液重懸，4 ℃避光儲(chǔ)存；⑩處理后樣本上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NCSLC患者腫瘤組織與癌旁組織中細(xì)胞細(xì)胞比率比較(見表1)

表1 NSCLC患者腫瘤組織及癌旁組織中細(xì)胞、細(xì)胞比率

二、NCSLC患者腫瘤組織與癌旁組織中Treg細(xì)胞比率細(xì)胞中Treg細(xì)胞比率、TIL細(xì)胞比率的比較 (見表2)

表2 NSCLC腫瘤組織及癌旁組織中Treg細(xì)胞占總細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞占細(xì)胞比率、TIL細(xì)胞比率

三、NCSLC患者腫瘤組織與癌旁組織中G-MDSC、M-MDSC細(xì)胞、Macrophages、CD163+ Macrophages(M2)細(xì)胞比率的比較(見表3)

NCSLC 患者腫瘤組織中G-MDSC細(xì)胞比率較癌旁組織升高(P>0.05)。NCSLC 患者腫瘤組織中M-MDSC細(xì)胞比率較癌旁組織升高(P<0.01)。NCSLC 患者腫瘤組織中總Macrophage細(xì)胞比率較癌旁組織降低(P<0.01)。NCSLC 患者腫瘤組織中CD163+ Macrophage(M2)細(xì)胞比率較癌旁組織升高(P>0.05)。

四、不同臨床病理特征的NSCLC患者腫瘤組織中各細(xì)胞比率的比較(見表4)

NCSLC 患者腫瘤組織中Treg細(xì)胞占總T細(xì)胞比率、TIL、G-MDSC、M-MDSC、Macrophages和CD163+ Macrophages(M2)細(xì)胞比率與患者性別、年齡、腫瘤病理類型、腫瘤分期、腫瘤大小以及腫瘤是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 NSCLC腫瘤組織及癌旁組織中G-MDSC、M-MDSC、Macrophages、CD163+ Macrophages(M2型)細(xì)胞比率{% , P50(IQR)}

表4 NSCLC患者腫瘤組織中各細(xì)胞比率與不同臨床病理特征的相關(guān)性

表4(續(xù)) NSCLC患者腫瘤組織中TIL細(xì)胞比率與不同臨床病理特征的相關(guān)性

表4 (續(xù)) NSCLC患者腫瘤組織中G-MDSC、M-MDSC細(xì)胞比率與不同臨床病理特征的相關(guān)性{% , P50(IQR)}

表4(續(xù)) NSCLC患者腫瘤組織中Macrophages、CD163 Macrophages(M2)細(xì)胞比率與不同臨床病理特征的相關(guān)性{% , P50(IQR)}

討 論

腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移并非單一因素所造成，其中涉及到多種要素的共同作用，而免疫監(jiān)視和免疫耐受的失衡是腫瘤形成的基本因素。Christelle等人的免疫表型研究證實(shí)，晚期肺部腫瘤患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境呈現(xiàn)免疫抑制的狀態(tài)[5]。

研究表明MDSC除了具有固有的免疫抑制的功能外，MDSCs還與巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)在腫瘤微環(huán)境中相互作用并交叉促進(jìn)其免疫抑制活性[16]。Yoshikane[17]等人通過檢測(cè)可切除NSCLC患者腫瘤及循環(huán)中MDSC細(xì)胞表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者與正常人相比，循環(huán)單核細(xì)胞(M-MDSCs)的表達(dá)水平顯著增加。本研究結(jié)果也提示，在NSCLC患者腫瘤組織中，M-MDSC表達(dá)水平較癌旁正常組織升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Argyropoulos[18]在有關(guān)于MDSC在MF(蕈樣肉芽腫)中表達(dá)及其意義的研究中發(fā)現(xiàn)，晚期MF樣本與早期MF樣本的循環(huán)G-MDSC水平?jīng)]有差異，但總體生存分析顯示，腫瘤內(nèi)MDSC富集的MF患者比無MDSC的患者生存期短，循環(huán)中G-MDSC水平高的患者預(yù)后也明顯較差，此外，循環(huán)中的G-MDSC水平與臨床分期無顯著相關(guān)性。最新一項(xiàng)研究對(duì)53例接受nivolumab治療的晚期NSCLC進(jìn)行血液分析，結(jié)果提示高G-MDSC水平和低CD8/G-MDSC比值與NSCLC免疫治療的療效具有顯著相關(guān)性，闡述了G-MDSC作為NSCLC患者接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑的潛在生物標(biāo)志物具有重要意義[19]。同樣的，在建立的小鼠模型中，當(dāng)小鼠4個(gè)月大時(shí)在肺部出現(xiàn)腫瘤病變后，能夠觀察到免疫抑制性MDSC的積聚，而當(dāng)敲除S100A9基因后，兩種模型中MDSC的積累均被消除，同時(shí)小鼠的存活率也獲得了顯著提高，提示了MDSC在腫瘤的形成全過程中具有重要的意義[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDSC與NSCLC患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無明顯相關(guān)性，可能是由于MDSC與其他免疫抑制細(xì)胞(如Treg細(xì)胞和TAMs)不同，MDSC沒有統(tǒng)一的分子表型。其次，不同MDSC亞型與肺癌預(yù)后的關(guān)系結(jié)果也不一致[21]。此外，由于本研究標(biāo)本送檢途中經(jīng)低溫保存，而此前有研究提示，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本經(jīng)凍存后將導(dǎo)致兩個(gè)MDSC亞群的頻率明顯降低[22]，因此本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能稍有偏差，因此導(dǎo)致結(jié)果的偏移。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)根據(jù)細(xì)胞表型可分為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1型)和替代性活化巨噬細(xì)胞(M2型)，M1型巨噬細(xì)胞主要通過分泌釋放促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子、效應(yīng)分子以及趨化因子，從而發(fā)揮殺傷細(xì)菌、抗腫瘤、激活免疫應(yīng)答的功能；M2型巨噬細(xì)胞則通過分泌IL-4/10等多種抗炎癥反應(yīng)因子，并且通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)血管生成、淋巴管生成、組織重建以及損傷修復(fù)作用，并且通過 Th2 細(xì)胞應(yīng)答，抑制免疫應(yīng)答，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程提供了促進(jìn)作用[23-24]。有研究測(cè)定了41例肺癌標(biāo)本的瘤內(nèi)微血管計(jì)數(shù)和巨噬細(xì)胞密度，并與患者的臨床預(yù)后進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果提示TAM的密度與腫瘤微血管的密度具有相關(guān)性，巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)后顯著增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞侵襲能力，這一結(jié)果提示TAM與腫瘤的進(jìn)展有相關(guān)性。在機(jī)體的正常免疫系統(tǒng)內(nèi)，M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞處于一種相對(duì)的功能平衡的狀態(tài)，一旦機(jī)體出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)，隨著腫瘤逐漸向惡性進(jìn)展，巨噬細(xì)胞的細(xì)胞表型會(huì)由M1型發(fā)生極化轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，促進(jìn)腫瘤的形成[25]。吳鵬[26]的研究發(fā)現(xiàn)通過JQ1抑制IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M2型的極化后，可以明顯降低M2型巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用，同時(shí)小鼠模型的乳腺原位腫瘤的生長(zhǎng)速率及肺轉(zhuǎn)移率也獲得了明顯降低。本研究用CD163標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平較癌旁正常組織升高，但結(jié)果無顯著差異。此前有針對(duì)乳腺癌組織中巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞也存在于無明顯炎癥反應(yīng)的癌癥中，當(dāng)腫瘤逐漸向惡性轉(zhuǎn)變時(shí)，巨噬細(xì)胞大量向良性腫瘤的部位聚集[25]。這或許可以解釋在NSCLC腫瘤組織中總的巨噬細(xì)胞表達(dá)水平較癌旁組織中低的原因，我們的研究結(jié)果可能提示隨著腫瘤的進(jìn)展過程，M2型巨噬細(xì)胞逐漸向腫瘤外擴(kuò)散遷移，從而誘導(dǎo)NSCLC腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。總的來說，綜合此前的研究來看，我們可以認(rèn)為，巨噬細(xì)胞與NSCLC的進(jìn)展息息相關(guān)，但是值得慶幸的是，我們已經(jīng)了解了巨噬細(xì)胞在腫瘤的形成過程中的主要機(jī)制，因此，認(rèn)為通過有效控制M1型巨噬細(xì)胞向M2型的極化過程，或許是一種新的研究方向，為臨床腫瘤的治療帶了新的想法。