老年晚期肺腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞變化與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

王瑋 葉維潔 王玉樹 張為強(qiáng)

我國屬全球肺癌高發(fā)國家之一，非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的85%～90%，其中肺腺癌相對(duì)常見[1]。目前手術(shù)仍為早期肺腺癌治療的首選，但術(shù)后患者5年生存率僅為40%～65%[2]。且肺腺癌癥狀隱匿，較大一部分就診時(shí)已屬晚期，喪失外科根治機(jī)會(huì)，術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，5年生存率低[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)系自發(fā)原因或診療過程自原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入人體外周血循環(huán)或淋巴系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞類型[4]。目前越來越多證據(jù)顯示，CTC是促使癌癥轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的高危因素[5-6]。前期已有文獻(xiàn)報(bào)道，CTC數(shù)目與膀胱癌惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，參與癌細(xì)胞浸潤過程[7]。也有研究認(rèn)為通過檢測CTC數(shù)目可預(yù)測胃癌預(yù)后[8]。但對(duì)CTC檢測在肺腺癌診治方面的報(bào)道相對(duì)少見。本研究擬通過免疫磁珠法聯(lián)合免疫熒光原位雜交法檢測老年晚期肺腺癌血CTC數(shù)目，并探究其與肺腺癌臨床病理參數(shù)、療效及預(yù)后的關(guān)聯(lián)，以期為老年晚期肺腺癌診治與預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

資料與方法

一、 一般資料

收集2017年1月～2018年1月醫(yī)院收治經(jīng)病理確診的老年晚期肺腺癌95例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲；②經(jīng)病理確診為肺腺癌，臨床分期Ⅲ～Ⅳ[9]，至少存在1個(gè)可測病灶；③入組前未接受抗腫瘤治療；④無其他器官惡性腫瘤；⑤預(yù)計(jì)生存期超過3個(gè)月；⑥均隨訪至2019年6月；⑥病例資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心肝腎器質(zhì)性障礙；②嚴(yán)重腦血管疾??；③合并其他惡性腫瘤；④無法控制嚴(yán)重內(nèi)科疾??；⑤急慢性感染；⑥自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病；⑦臨床或隨訪資料不全。其中男64例，女31例；年齡60～78歲，平均(72.6±7.4)歲；有吸煙史52例；病理分化程度：低分化61例，高、中分化34例；臨床分期：Ⅲ期36例，Ⅳ期59例。入選所有對(duì)象均獲得患者及家屬知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

二、 方法

1 主要試劑及儀器 CTC試劑盒、免疫納米磁微粒(Norway Life科技公司)，人淋巴細(xì)胞分離液(美國Sigma公司)，鼠抗CK8、CK19、CK20異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體、抗CD45抗體(美國Abcam公司)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，RPMT1640、Tritonx-100(北京賽默飛有限公司)；磁力架(Norway Life科技公司)，離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)，恒溫?fù)u床(美國STIK公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，Cell Tracks AnalyzerⅡ分析儀、原位雜交儀(北京賽默飛有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 所有晚期肺腺癌患者除表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變陽性(經(jīng)證實(shí)均為EGFR野生型突變)36例外均接受含鉑類雙藥化療方案，包括培美曲塞+順鉑45例，吉西他濱+卡鉑8例，多西他賽+卡鉑6例，均以3周為1個(gè)周期，伴EGFR基因突變36例患者先采用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑靶向治療后再行含鉑類雙藥化療?；熐? d、化療2個(gè)周期后均采集老年肺腺癌病例空腹外周靜脈血7 mL，抗凝劑抗凝，血標(biāo)本采集24 h內(nèi)以免疫磁珠法聯(lián)合免疫熒光原位雜交法檢測CTC。①免疫磁珠法富集CTC。血樣加入等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)試管內(nèi)混合均勻，加入淋巴細(xì)胞分離液4 mL，2 500 r/min離心25 min(室溫)，吸取乳白色單核細(xì)胞至離心管內(nèi)，加入等體積PBS混合均勻，1 500 r/min離心15 min(室溫)，棄上清，取沉淀單核細(xì)胞。磁微?；鞈乙?150 μL/份)加入至含1 mL Buffer1(PBS 100 mL+BSA 0.1 g，PH值=7.4)離心管內(nèi)輕柔吹打混合均勻，磁力架靜置60 s，棄上清，PBS洗滌3次，加入50 μl Buffer1重懸磁微粒至150 μL保存?zhèn)溆?。單核?xì)胞樣本內(nèi)緩慢加入磁微粒，搖床120次/min共20 min(室溫)，加入Buffer2(PBS 100 mL+BSA 0.1 g+2MmEDTA)1mL，600 g離心10 min，棄上清，加Buffer2 1mL重懸，置于磁力架120 s，棄上清，加Buffer1 1mL混勻，加200 μL Buffer3(RPMT1640 100 mL+CaCl2 1 m+MgCl2 5 m，PH值=7.0～7.4)重懸，加4 μl Release Buffer1，室溫靜置15 min，吹打10～15次，置于磁力架120 s，上清液滴于載玻片，自然風(fēng)干。②免疫熒光法測定CTC。甲醛(4%)固定30 min(室溫)，PBS洗滌5 min×3次，加入Tritonx-100(0.2%)透化3 min，PBS洗滌5 min×3次，BSA(5%)封閉0.5 h，加1% BSA稀釋一抗(鼠抗CK8、CK19、CK20異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體、抗CD45抗體)置于濕盒內(nèi)4℃過夜，PBS洗滌5 min×3次，加1%BSA稀釋二抗(異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG)，37℃避光孵育0.5 h，PBS洗滌5 min×3次，DAPI核染色0.5 h，PBS洗滌5 min×3次，鏡下(熒光顯微鏡)觀察CTC陽性情況。

3 CTC陽性標(biāo)準(zhǔn) 參照文獻(xiàn)[10]。CK8、CK19、CK20陽性，呈綠色；CD45陰性；DAPI核染，呈紫藍(lán)色；細(xì)胞形態(tài)完整，體積>4×4 μm2。

4 療效判定 所有患者每2周期均進(jìn)行影像學(xué)檢查評(píng)估療效，參照實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)[11]。分為完全緩解(complete response，CR；可測病灶消失，持續(xù)4周)、部分緩解(partial response，PR；基線病灶長徑綜合縮小超過30%，至少保持4周)、穩(wěn)定(stable disease，SD；基線長徑總和有所縮小但未達(dá)部分緩解標(biāo)準(zhǔn)，或有增加但不及20%)與進(jìn)展(progressive disease，PD；基線長徑總和增加超過20%或有新病灶出現(xiàn))。

5 隨訪及預(yù)后監(jiān)測 所有肺腺癌患者隨訪至2019年6月，出院后每3個(gè)月隨訪1次，半年后每6個(gè)月隨訪1次，以門診復(fù)查或電話隨訪的方式，以隨訪時(shí)間結(jié)束或病情進(jìn)展或死亡作為觀察終點(diǎn)，詳細(xì)記錄所有病例臨床病理資料，包括人口學(xué)資料、腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、EGFR基因突變及無進(jìn)展生存期(術(shù)后至疾病復(fù)發(fā)或末次隨訪時(shí)間)等。以病理活檢或明確影像學(xué)檢查存在病灶視為復(fù)發(fā)。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、肺腺癌患者化療前CTC陽性率

95肺腺癌患者化療前CTC陽性62例，陽性率為65.26%；化療2個(gè)周期后CTC陽性45例，陽性率為47.37%，與化療前CTC陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 肺腺癌患者化療前CTC陽性率比較[n(%)]

二、 肺腺癌CTC陽性率與療效關(guān)系

95例肺腺癌患者化療2個(gè)周期后通過影像學(xué)檢查評(píng)估療效，其中完全緩解0例，部分緩解31例，穩(wěn)定52例，進(jìn)展12例，總緩解率為32.63%；化療2個(gè)周期后CTC數(shù)目較化療前降低58例，不變10例，升高27例。CTC數(shù)目減少患者化療效果等級(jí)優(yōu)于CTC數(shù)目不變與增多患者(P<0.05)(見表2)。

三、化療前肺腺癌外周血CTC陽性率與臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、不同年齡、有無吸煙史肺腺癌患者CTC陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，臨床分期為Ⅳ期、病理分化程度為低分化、浸潤范圍為T3～T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N3期、存在EGFR基因突變的肺腺癌患者血CTC陽性率高于臨床分期為Ⅲ期、病理分化程度為中高分化、浸潤范圍為T1～T2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N0～N2期、無EGFR基因突變的患者，以上數(shù)據(jù)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表2 肺腺癌CTC陽性率與療效關(guān)系[n(%)]

表3 肺腺癌外周血CTC與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

四、CTC陽性、陰性肺腺癌患者無進(jìn)展生存期比較

所有患者均隨訪至2019年6月，平均隨訪時(shí)間(13.61±2.72)個(gè)月，隨訪截止日95例患者累積疾病進(jìn)展19例(20.00%)，CTC陽性患者17例(27.42%，17/62)，陰性2例(6.06%，2/33)，CTC陽性、陰性患者隨訪截止日無進(jìn)展生存率分別為72.58%(45/62)、93.94%(31/33)，中位無進(jìn)展生存時(shí)間分別為11.29個(gè)月與13.04個(gè)月，Log-Rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.906，P=0.027<0.05)(見圖1)。

圖1 CTC陽性、陰性肺腺癌無進(jìn)展生存曲線

五、肺腺癌老年患者無進(jìn)展生存期影響因素單因素分析

單因素分析顯示：腫瘤分化程度、浸潤范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CTC、EGFR基因突變?yōu)橛绊懤夏攴蜗侔┗颊邿o進(jìn)展生存期的因素(P<0.05)(見表4、圖2～9)。

圖2 不同性別肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

六、肺腺癌老年患者無進(jìn)展生存期多因素分析

多因素Logistic回歸分析顯示：性別、年齡、吸煙史、腫瘤分化程度與肺腺癌老年無進(jìn)展生存期無關(guān)(P>0.05)。臨床分期、浸潤范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CTC、EGFR基因突變均與無進(jìn)展生存期有關(guān)(P<0.05)，即臨床分期越高、浸潤范圍越廣、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴EGFR基因突變及CTC陽性肺腺癌患者無進(jìn)展生存期越短(見表5)。

表4 肺腺癌老年患者無進(jìn)展生存期影響因素單因素分析(月)

表5 肺腺癌老年患者無進(jìn)展生存期多因素分析

討 論

肺腺癌約占全部肺癌的1/2[12]。目前臨床公認(rèn)肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與腫瘤微小灶殘留(隱匿性轉(zhuǎn)移灶或術(shù)后原發(fā)灶或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶殘留)有關(guān)[13-14]。肺腺癌患者術(shù)后或抗腫瘤治療后大部分癌細(xì)胞被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，而少部分產(chǎn)生免疫逃逸，在炎癥或其他因素刺激下激活，導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移[15]。

一、 老年晚期肺腺癌CTC陽性情況及與療效療效的關(guān)系

圖3 不同年齡肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

圖4 有無吸煙史肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

圖5 不同臨床分期肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

圖6 不同浸潤范圍肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

圖7 不同分化程度肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

圖8 不同N分期肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

圖9 EGFR基因突變與未突變肺腺癌無進(jìn)展生存期比較

CTC系自原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)的癌細(xì)胞類型[16]。國外解剖學(xué)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，癌癥患者尸體外周血存在與腫瘤原發(fā)灶癌細(xì)胞相似成分，并首次提出CTC概念[17]。最新研究表明，檢測CTC有助于腫瘤相關(guān)疾病診斷及預(yù)后評(píng)定[18]。朱穎等[19]認(rèn)為，肺癌形成影像學(xué)可探測結(jié)節(jié)性病變時(shí)癌灶直徑已超過1 cm，而此前患者外周血內(nèi)已可檢出CTC，該觀點(diǎn)認(rèn)為血CTC對(duì)肺癌診斷價(jià)值更高。近期也有報(bào)道表示，外周血檢出CTC但胸部影像學(xué)陰性病例在隨診5年內(nèi)皆可發(fā)現(xiàn)可切除肺部癌結(jié)節(jié)[20]。且Xu等[21]指出，肺癌患者血CTC水平與原發(fā)灶基因突變存在緊密聯(lián)系。但對(duì)老年晚期肺腺癌CTC檢測的作用尚少見報(bào)道。本研究對(duì)老年晚期肺腺癌病例外周血CTC進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化療前老年晚期肺腺癌患者CTC陽性率高達(dá)65.26%，表明CTC可能參與肺腺癌發(fā)病過程，或可能為肺腺癌癌灶進(jìn)展或擴(kuò)散的早期標(biāo)志物。我們發(fā)現(xiàn)在對(duì)晚期肺腺癌老年患者進(jìn)行2個(gè)周期化療后，患者CTC陽性率明顯降低，并發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)目較化療前減少肺腺癌病例大部分均可獲得部分緩解或穩(wěn)定的效果，化療等級(jí)優(yōu)于CTC數(shù)目不變或增多病例，提示CTC數(shù)目改變與肺腺癌影像學(xué)療效評(píng)估存在一定的關(guān)聯(lián)，或推測CTC有望作為肺腺癌化療效果預(yù)測的依據(jù)。但仍有病灶縮小或穩(wěn)定患者CTC數(shù)目增多的情況，考慮癌組織自身具有侵襲及破壞微血管的能力，即便病灶縮小或穩(wěn)定，病灶內(nèi)癌細(xì)胞仍可通過微血管脫落途徑進(jìn)入外周血循環(huán)，造成微轉(zhuǎn)移。故不可籠統(tǒng)將外周血檢出CTC增多病例界定為腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移。

二、老年晚期肺腺癌CTC陽性情況與預(yù)后的關(guān)系

趙旭東等[22]報(bào)道，胰腺導(dǎo)管腺癌患者CTC水平與病情進(jìn)展及腫瘤惡性生物學(xué)行為有關(guān)。我們對(duì)CTC與肺腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)，CTC與肺腺癌病理分化程度、浸潤范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及EGFR基因突變均密切相關(guān)，病理分化程度越低、浸潤范圍越廣且存在廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、EGFR基因突變的肺腺癌有更高的CTC陽性率，該結(jié)論與Wang等[23]研究結(jié)果相似，提示外周血CTC水平可提示肺腺癌病情進(jìn)展，可敏感反映癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移情況，且可能與EGFR基因突變存在關(guān)聯(lián)。EGFR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生長、增殖、分化有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，且與癌細(xì)胞增殖、新生血管生成、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移緊密有關(guān)，是維持癌細(xì)胞“永生”的重要原因，一旦發(fā)生EGFR基因突變，癌細(xì)胞功能持續(xù)活化，EGFR表達(dá)持續(xù)增多，進(jìn)而促成癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，超過90%的癌癥患者死于癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[24]。而CTC是癌灶轉(zhuǎn)移的前提，監(jiān)測外周血CTC水平對(duì)監(jiān)測癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有積極的價(jià)值。我們發(fā)現(xiàn)，CTC陽性肺腺癌患者無進(jìn)展生存期低于陰性患者，進(jìn)行單因素、多因素分析皆證實(shí)其為影響肺腺癌無進(jìn)展生存期的相關(guān)因素，與Murlidhar等[25]報(bào)道結(jié)果相同，證實(shí)CTC陽性通常提示老年肺腺癌更差的預(yù)后。分析機(jī)制可能為：CTC可為癌細(xì)胞提供保護(hù)，促使其逃逸免疫監(jiān)視，逃避細(xì)胞凋亡；同時(shí)CTC相互作用可促進(jìn)癌細(xì)胞存活，且多個(gè)癌細(xì)胞聚集后與成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞等結(jié)合后形成CTC簇，轉(zhuǎn)移潛能更高，提升癌細(xì)胞致瘤潛力，促進(jìn)其惡性轉(zhuǎn)化，并通過血循環(huán)覆蓋全身，引起遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，引起不良預(yù)后[26]。同時(shí)CTC簇形成后可能造成靜脈血栓栓塞，進(jìn)一步加重病情[27]。此外，我們進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期、浸潤范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、EGFR基因突變?yōu)槔夏攴蜗侔┗颊邿o進(jìn)展生存期影響因素，考慮癌細(xì)胞侵襲性、惡性轉(zhuǎn)化均與以上各因子有關(guān)，即臨床分期越高、浸潤范圍越廣且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、EGFR基因突變的患者癌細(xì)胞侵襲性更高，更易呈現(xiàn)惡性表型，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后更差[28]。

故我們得出結(jié)論，老年晚期肺腺癌CTC陽性率較高，且CTC水平與肺腺癌病理進(jìn)展有關(guān)，高CTC陽性率通常提示不良預(yù)后，其可能通過提高癌細(xì)胞侵襲性、促進(jìn)其惡性表型轉(zhuǎn)化等途徑促成腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后。但本研究樣本量較少、觀察時(shí)間較短，存在一定的局限性，后續(xù)需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量、延長隨訪時(shí)間、多次取樣動(dòng)態(tài)檢測CTC證實(shí)該結(jié)論。