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    雙酚A替代品與雙酚A對非洲爪蛙急性毒性及其應激響應的比較

    2020-07-02 14:30:24牛玥朱敏劉芃巖秦占芬
    生態(tài)毒理學報 2020年2期
    關鍵詞:替代品蝌蚪休克

    牛玥,朱敏,劉芃巖,秦占芬,*

    1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室,北京 100085 2. 河北大學化學與環(huán)境科學學院,保定 071002 3. 中國科學院大學,北京 100049

    雙酚A(bisphenol A, BPA)是全球大量生產的化學品之一,主要用于生產聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂[1]。動物和人類通過多種途徑暴露于這種化學物質[2]。動物試驗研究表明,BPA在生物體生殖、發(fā)育和神經功能等方面具有毒性效應[3-5],近幾年的流行病學調查數據也表明,BPA與人類某些疾病相關[6],所以,一些國家和政府開始限制BPA的使用范圍。相應地,BPA類似物開始作為BPA的替代品被投入生產和使用,如雙酚F(bisphenol F, BPF)、雙酚S(bisphenol S, BPS)、雙酚AF(bisphenol AF, BPAF)等。BPA替代品在多種環(huán)境介質、生物樣品乃至人體樣品中都有檢出[7-9],因此,BPA替代品的安全性受到越來越廣泛的關注。

    BPA替代品與BPA的化學結構相似[10],可能存在與BPA類似的效應,已有文獻報道BPF、BPS有與BPA類似的激素活性[11],可產生內分泌干擾效應[12]。資料顯示,BPA對大鼠、小鼠和兔的經口暴露半致死劑量(LD50)分別為240、3 250和2 230 mg·kg-1[13-14];BPF對大鼠的經口暴露LD50為4 950 mg·kg-1[13-14]。李圓圓等[15]發(fā)現,BPA和BPF對黑斑蛙蝌蚪的半致死濃度(LC50)分別為9.00和9.52 mg·L-1;任文娟等[16]報道了BPA、BPF和BPAF對斑馬魚的LC50分別為8.09、9.51和2.47 mg·L-1。當生物體暴露于化學品時,生物體為保護自身免受損傷而做出一系列的應激響應[17],如氧化應激與熱休克反應。在生物體內谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase, GST)和硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)等是氧化應激的良好指標[18]。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是生物體在不良環(huán)境因素作用下所產生的一組特殊的蛋白質,能維持細胞穩(wěn)態(tài)應對環(huán)境變化,從而起到分子伴侶的作用。HSPs基因一般主要分為hsp90、hsp70、hsp60和小hsp共4個家族。氧化應激與熱休克反應是應激響應的主要組分,是生態(tài)毒理學中用來評價化學品毒性的常用指標[18]。許多體外和動物試驗表明,BPA可以誘導生物體釋放活性氧產生氧化應激[18-19]。Jain等[20]研究發(fā)現,BPA暴露導致大鼠體內活性氧水平升高,產生氧化應激。還有研究表明,BPA不但能夠改變秀麗隱桿線蟲幼蟲中GST活性,還能夠改變蝸牛體內hsp70和hsp90的表達[17,21]。流行病學研究表明,人體尿液中BPA的濃度與氧化應激水平相關[22-24]。

    本文選用兩棲動物非洲爪蛙作為實驗材料,通過研究LC50、氧化應激和熱休克蛋白相關基因轉錄水平,比較BPA及替代品對非洲爪蛙的急性毒性以及其引起的蛙體的應激響應,從而進一步分析BPA及替代品的生態(tài)風險,同時為BPA及替代品的毒性研究提供有效數據。

    1 材料與方法 (Materials and methods)

    1.1 實驗動物

    本實驗室飼養(yǎng)的非洲爪蛙的成年雌蛙和雄蛙,分養(yǎng)于盛有去氯自來水的玻璃缸中,水溫(22±2) ℃,明暗光周期為12 h∶12 h。成蛙喂食1∶1配比的豬肝和商品飼料,喂食2 h后換水,每周2次。

    非洲爪蛙雌蛙皮下注射300~500 IU促黃體素釋放激素(LHRH)和人絨毛膜促性腺激素(HCG),雄蛙注射200~300 IU的上述激素。將雌雄蛙放于產卵容器中,置于黑暗、安靜的環(huán)境中讓其抱對,12 h左右即可產卵。受精卵在(22±1) ℃的去氯自來水中孵化,胚胎發(fā)育至48期的蝌蚪,進行暴露試驗。

    1.2 試劑與儀器

    儀器和設備:高速冰凍離心機(5810/5810R,Eppendorf,德國);PCR儀( MiniAmp,Applied Biosystem,美國);熒光定量PCR儀(MX3500P,Strata gene,美國);組織碾磨儀(MM301,Retsch,德國);渦旋混勻器(VORTEX 2,WIGGENS,美國);全自動核酸提取儀(AU1001,北京百泰克生物技術有限公司);電子天平(JA2003B,上海越平科技儀器有限公司);移液器(Eppendorf,德國);全自動凝膠成像儀(GBOX-HR,Syn Gene,英國);普通PCR儀(My Cycler TM,BIO-RAD,美國);電泳儀(DYCP-31F,北京六一儀器廠)。

    試劑:BPA(CAS No. 80-05-7,純度97%,ACROS Organics,分子量228.29);BPF(CAS No. 620-92-8,純度>99%,東京化成工業(yè),分子量200.24);BPAF(CAS No. 1478-61-1,純度99%,北京百靈威科技有限公司,分子量336.23);二甲基亞砜(DMSO,CAS No. 67-68-5,純度≥99.5%,Sigma-Aldrich,美國);核酸染料(G-red)和RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司);反轉錄試劑盒Fast Quant RT Kit和RT-qPCR試劑盒Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)kit(天根生化科技有限公司,北京);PCR引物(華大基因,北京)。

    1.3 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性試驗

    BPA、BPF和BPAF用助溶劑DMSO配成100 g·L-1的儲備液。設置溶劑對照組,其中溶劑的濃度與最高濃度處理組溶劑濃度相同,溶劑的體積濃度不超過0.01%。暴露實驗在玻璃缸內進行,每個缸盛有1 L暴露液,蝌蚪隨機放入10尾。每隔24 h換一次水,清除死亡個體,記錄死亡數,實驗持續(xù)48 h。

    在正式實驗之前先對3種化學物質進行較大濃度范圍(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的預試驗,不設平行組,各濃度的缸中加入10尾蝌蚪,觀察記錄48 h蝌蚪死亡數。根據預試驗得出的結果,設置正式試驗濃度。正式試驗以1.2為公比設置5個濃度梯度(表1)和溶劑對照組,每組3個平行,每個缸中隨機加入10尾蝌蚪。其他同預實驗,重復2次正式試驗。

    表1 雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)和雙酚AF(BPAF)的濃度設置Table 1 Concentration of bisphenol A (BPA), bisphenol F (BPF) and bisphenol AF (BPAF)

    1.4 RNA提取和RT-qPCR

    每個缸隨機取2尾蝌蚪,全自動核酸提取儀提取RNA,超微量分光光度計測定RNA濃度,用瓊脂糖凝膠電泳來確定RNA完整性。然后根據Fast Quant RT Kit(with g DNase)說明書配制20 μL反應體系進行反轉錄。

    根據SYBR Green PCR Kit說明,配制10 μL反應體系進行RT-qPCR。PCR程序為:95 ℃預變性15 min,40個循環(huán)擴增(95 ℃變性10 s、退火20 s、72 ℃延伸20 s)。每個基因在使用之前都進行了擴增效率的驗證,計算公式為E=(10-1/slope-1)×100。擴增效率在90%~110%之間、溶解曲線單一且重合、不存在非特異性擴增的基因時,可用于后續(xù)實驗。進行基因表達分析時,以rpl8為管家基因對各個基因的表達進行標準化[25]?;虻南鄬Ρ磉_量根據公式2-ΔΔCT計算[26]。引物及相關信息如表2所示。

    1.5 數據統(tǒng)計

    用SPSS 16.0進行數據分析。統(tǒng)計單元為缸,即n值等于平行缸數[27]。重復2次正式試驗,得到相似的結果,在文中只呈現其中一次的試驗數據[28]。回歸分析使用Probit,建立“劑量-效應”線性方程,并計算LC50值及其95%置信區(qū)間。統(tǒng)計數據均以平均值±標準誤(standard error of mean, SEM)表示。暴露組與各自的對照相比,顯著性差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析,P值<0.05認為有顯著性差異。

    2 結果(Results)

    2.1 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性試驗

    溶劑對照組中非洲爪蛙蝌蚪無死亡,試驗質量控制良好。BPA、BPF和BPAF暴露組蝌蚪均有不同程度的死亡(圖1)。24 h時,4.82 mg·L-1BPA、7.23 mg·L-1BPF和1.93 mg·L-1BPAF暴露組的蝌蚪存活率分別為93.33%、83.33%和100%,10.00 mg·L-1BPA暴露組蝌蚪的存活率為20%,15.00 mg·L-1BPF和4.00 mg·L-1BPAF暴露組蝌蚪的存活率相同,均為0%。48 h時,5.79 mg·L-1的BPA暴露組中蝌蚪的存活率由24 h的76.67%下降到73.33%,12.50 mg·L-1的BPF暴露組的蝌蚪存活率與24 h時相比下降了16.67%,其他濃度暴露組的蝌蚪存活率不變。觀察蝌蚪死亡現象時發(fā)現,15.00 mg·L-1BPF暴露組實驗開始不久,蝌蚪沉到水底,很快死亡,其他濃度BPF暴露組的部分蝌蚪也出現了上述現象,并清楚看到存活蝌蚪的腮充血,在顯微鏡下觀察發(fā)現,存活蝌蚪心臟的血液回流緩慢甚至堵塞。暴露于4.00 mg·L-1BPAF的蝌蚪,先是快速沒有規(guī)律地游動,同時皮膚迅速發(fā)白,很快死亡,這種現象隨暴露組濃度的降低而消失。10.00 mg·L-1BPA暴露組的蝌蚪,行動遲緩,最終死亡,其他濃度BPA暴露組的部分蝌蚪也出現該現象,暴露組濃度越低該現象越不明顯。

    經統(tǒng)計分析得到BPA、BPF和BPAF對蝌蚪的24 h-LC50分別為7.59、11.58和2.87 mg·L-1;48 h-LC50分別為7.54、11.01和2.87 mg·L-1(表3)。毒性強弱順序為BPAF>BPA>BPF。

    圖1 BPA、BPF和BPAF暴露后非洲爪蛙蝌蚪的存活率Fig. 1 Survival rates of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA, BPF and BPAF

    表2 RT-qPCR引物及相關信息Table 2 Primers sequences and relevant information for RT-qPCR

    表3 BPA、BPF和BPAF對非洲爪蛙蝌蚪的LC50及其95%置信區(qū)間和回歸方程Table 3 LC50, 95% confidence interval and regression equations of BPA, BPF and BPAF to Xenopus laevis tadpoles

    注:LC50及其95%置信區(qū)間的單位為mg·L-1。

    Note: The unit of LC50and its 95% confidence interval is mg·L-1.

    2.2 BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內氧化應激相關基因轉錄水平的影響

    RT-qPCR結果表明(圖2),暴露48 h后,4.82~10.00 mg·L-1的BPA和7.23~12.50 mg·L-1的BPF顯著上調蝌蚪體內gr、gst和trx這3種基因的轉錄水平,呈線性劑量-效應關系。8.68 mg·L-1BPF暴露組蝌蚪體內gst的相對表達量遠高于8.33 mg·L-1BPA暴露組。8.68 mg·L-1BPF暴露組蝌蚪體內gr和trx的表達量與8.33 mg·L-1BPA暴露組類似。4.82~10.00 mg·L-1的BPA顯著下調蝌蚪體內gpx的轉錄水平,7.23~8.68 mg·L-1的BPF與4.82~10.00 mg·L-1的BPA類似,但12.50 mg·L-1的BPF顯著上調gpx的轉錄水平,呈現高濃度促進低濃度抑制的趨勢。BPAF暴露組蝌蚪體內gst和gr基因的相對表達量與BPAF暴露濃度呈“倒U型”關系,濃度分別為2.78和2.31 mg·L-1時,gst和gr的相對表達量最高。2.31~3.33 mg·L-1的BPAF顯著上調蝌蚪體內trx和gpx的轉錄水平,呈線性劑量-效應關系。

    2.3 BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內熱休克蛋白轉錄水平的影響

    RT-qPCR結果表明(圖3),暴露48 h后,4.82~8.33 mg·L-1的BPA顯著下調蝌蚪體內hsp27和hsp90的轉錄水平,4.82~10.00 mg·L-1的BPA對蝌蚪體內hsp70的轉錄水平沒有顯著影響。與BPA不同,7.23~12.50 mg·L-1的BPF對蝌蚪體內hsp27、hsp70和hsp90的表達均沒有顯著影響,但15.00 mg·L-1的BPF顯著抑制hsp27和hsp90的表達水平。2.31~3.33 mg·L-1的BPAF顯著上調蝌蚪體內hsp70和hsp90的轉錄水平,呈線性劑量-效應關系,但對蝌蚪體內hsp27基因沒有顯著影響。

    3 討論(Discussion)

    檢測結果表明,BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪的48 h-LC50排序為:BPF(11.01 mg·L-1)>BPA(7.54 mg·L-1)>BPAF(2.87 mg·L-1)。根據危險化學品分類準則[29],BPA和BPAF對非洲爪蛙的毒性為中等毒性,BPF對非洲爪蛙的毒性略低于中等毒性標準。最近的研究表明,BPA及替代品對黑斑蛙和斑馬魚的毒性均為中等毒性[15-16]。

    圖2 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)對非洲爪蛙蝌蚪的氧化應激相關基因轉錄水平的影響注:*表示P<0.05。Fig. 2 Oxidative stress related gene transcription level of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

    圖3 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)對非洲爪蛙蝌蚪的熱休克蛋白轉錄水平的影響注:*表示P<0.05。Fig. 3 Transcriptional levels of heat-shock protein of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

    BPA和BPF對非洲爪蛙蝌蚪體內氧化應激相關基因gr、gst和trx轉錄水平的影響呈線性劑量-效應關系。對比BPF與BPA相似濃度暴露組(如8.68 mg·L-1BPF暴露組與8.33 mg·L-1BPA暴露組)蝌蚪體內gst、gr和trx的相對表達量后,發(fā)現BPF暴露組蝌蚪體內的gst基因的相對表達量高于BPA暴露組,BPF暴露組蝌蚪體內gr和trx的相對表達量與BPA暴露組類似。整體來看,BPF對蝌蚪體內氧化應激水平的影響與BPA相近。分析BPAF和BPA暴露組數據發(fā)現,2.31 mg·L-1的BPAF暴露組中蝌蚪體內gst、gr和trx基因的相對表達量與10.00 mg·L-1的BPA暴露組類似,此結果說明2.31 mg·L-1的BPAF與10.00 mg·L-1的BPA產生類似的氧化應激效應,所以BPAF對蝌蚪體內氧化應激水平的影響強于BPA。另發(fā)現,BPA及替代品對蝌蚪體內gpx基因表達水平的影響有所不同。BPA暴露組蝌蚪體內gpx表達被顯著下調;12.50 mg·L-1的BPF顯著上調蝌蚪體內gpx的表達水平,7.23~8.68 mg·L-1則顯著下調gpx的表達水平;BPAF顯著上調蝌蚪體內gpx基因的表達水平,呈線性劑量-效應關系。有研究表明,暴露于不同重金屬污染物的生物體內gpx的表達水平表現為雙向效應(降低或增加),主要取決于污染物種類[20-35]。這可能為BPA及替代品對蝌蚪體內gpx轉錄水平的不同影響提供合理的解釋。綜合考慮以上結果,BPF對非洲爪蛙體內氧化應激水平的影響與BPA相近,BPAF強于BPA。

    BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內熱休克蛋白表達的影響結果表明,BPA暴露組(10.00 mg·L-1除外)蝌蚪體內hsp27和hsp90的表達被顯著下調。Morales等[21]研究發(fā)現,蝸牛暴露于100和500 μg·L-1BPA 48 h后,體內hsp70和hsp90基因的轉錄水平下降。還有研究表明,秀麗隱桿線蟲暴露于250和500 μmol·L-1BPA 24 h后,體內的hsp70基因表達下調[17]。以上研究的實驗物種和BPA暴露濃度與本實驗不同,但BPA對生物體內熱休克蛋白的影響與本研究BPA的實驗結果類似。此外,BPF、BPAF對蝌蚪體內熱休克蛋白的影響與BPA不一致:7.23~12.50 mg·L-1的BPF對蝌蚪體內熱休克蛋白的表達水平沒有顯著影響,15.00 mg·L-1的BPF顯著下調hsp27和hsp90的表達;BPAF對蝌蚪體內hsp27的表達沒有顯著影響,但BPAF顯著上調蝌蚪體內hsp70和hsp90的表達,呈線性劑量-效應關系??傮w來看,BPA和BPAF均影響蝌蚪體內熱休克蛋白的表達水平,而BPF對蝌蚪體內熱休克蛋白表達沒有顯著影響。

    綜上所述,BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪的毒性強弱順序為:BPAF>BPA>BPF;BPAF對非洲爪蛙體內氧化應激水平的影響最大,BPF與BPA相近;BPA和BPAF顯著影響非洲爪蛙體內熱休克蛋白表達水平,BPF沒有影響顯著影響。本文可為BPA及替代品的生產和使用以及相應的環(huán)境管理提供毒理學參考數據。

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