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    環(huán)境劑量磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯多代暴露對斑馬魚子代仔魚的神經(jīng)發(fā)育毒性

    2020-07-02 14:30:14丁希勝馬徐發(fā)余麗琴
    生態(tài)毒理學報 2020年2期
    關鍵詞:仔魚斑馬魚子代

    丁希勝,馬徐發(fā),2,#,余麗琴,2,*

    1. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院,武漢 430070 2. 湖北省池塘養(yǎng)殖工程實驗室,武漢 430070

    有機磷阻燃劑被廣泛添加在電子設備、紡織品和家具等日常用品中,用于避免易燃物被引燃和延遲火災的蔓延[1-2]。作為主要的有機磷阻燃劑,磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)通常添加在家具、兒童泡沫玩具和汽車裝潢物中[3]。作為一種新型的環(huán)境污染物,在地表水、自來水、室內(nèi)空氣和水生生物體中,甚至人體代謝物中都有一定濃度的TDCIPP被檢出[4-5]。據(jù)報道,國內(nèi)松花江水樣中TDCIPP濃度范圍是2.5~40 ng·L-1[6-7]。在我國青島、廈門和連云港附近水域采集的水樣中,TDCIPP的最高濃度達377 ng·L-1[8]。我國南京市10個自來水廠水樣中TDCIPP的平均含量為8.5 ng·L-1[9]。在我國珠江三角洲區(qū)域生活的淡水魚肌肉中TDCIPP的蓄積量達到251 μg·kg-1[10]。

    近年來,大量的離體和活體實驗研究都表明了TDCIPP具有神經(jīng)毒性。例如,離體實驗結(jié)果表明,TDCIPP暴露降低了細胞的活力,提高了多種類型神經(jīng)細胞的凋亡率[11-13],并干擾大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)的細胞分化和細胞遷移[13]。一項活體研究表明,TDCIPP暴露導致稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)成魚體內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的基因表達顯著性降低[14]。在斑馬魚中,TDCIPP暴露可降低神經(jīng)遞質(zhì)(例如血清素和多巴胺)的水平,下調(diào)成魚和母體暴露后產(chǎn)下的子代仔魚(受精后5 d,5-day post-fertilization,5 dpf)中神經(jīng)發(fā)育相關基因的表達,包括髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,mbp)和突觸素Ⅱ(synapsin Ⅱa,syn2a)[15-16]。早期生命階段的研究表明,TDCIPP急性暴露會引起魚類顯著的行為改變,特別是仔魚游泳活動[17-21],推測魚類游泳行為的變化可能是TDCIPP暴露的敏感終點。但是,這些研究均是基于較高劑量的暴露實驗,有關環(huán)境劑量TDCIPP對魚類游泳行為的影響尚未知。此外,生物體在自然生態(tài)系統(tǒng)中往往長達多代都暴露于環(huán)境污染物中。所以,有必要研究環(huán)境劑量TDCIPP多代暴露對斑馬魚子代仔魚神經(jīng)發(fā)育的影響。

    在斑馬魚中,一些與胚胎/仔魚神經(jīng)發(fā)育相關的候選基因可以作為評價化合物神經(jīng)發(fā)育毒性的生物標志物[22]。其中,神經(jīng)元特異性RNA結(jié)合蛋白(ELAV like neuron-specific RNA binding protein 3,elavl3)和神經(jīng)原素1 (neurogenin-related gene 1,ngn1)是神經(jīng)元發(fā)育的標志基因[23-24]。α1微管蛋白(α1-tubulin)基因在神經(jīng)元軸突和樹突的發(fā)育和再生中起著非常重要的作用[25],生長相關蛋白(growth associated protein 43,gap43)基因在神經(jīng)元中軸突再生和發(fā)育時高表達[26],神經(jīng)生長因子(netrins)基因可以刺激斑馬魚胚胎中神經(jīng)元軸突的生長[27],zn5是第二運動神經(jīng)元軸突的標志基因[28-29]。音猬基因(shha)的功能主要是連接視網(wǎng)膜神經(jīng)調(diào)節(jié)細胞與脊髓軸突間的軸突索[30-31]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是一種中間絲蛋白,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細胞和放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞中高度表達,被作為星形膠質(zhì)細胞的標志物[32]。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)是斑馬魚正在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的髓鞘形成所必需的[33]。

    本文以斑馬魚為研究模型,將3代斑馬魚暴露于環(huán)境劑量的TDCIPP,評價每一代的子代仔魚生長發(fā)育以及運動行為所受到的影響,并考察神經(jīng)發(fā)育標志基因的表達變化,分析其與行為變化的相關性,探討影響行為的可能原因,評價TDCIPP多代暴露對其子代仔魚神經(jīng)發(fā)育的毒性效應,研究結(jié)果對全面評價TDCIPP的環(huán)境和人類健康風險具有重要的參考意義。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 實驗試劑

    磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)純度>95%,購自東京化成工業(yè)株式會社(東京,日本)。用于儲存和稀釋TDCIPP的二甲基亞砜(DMSO)純度>99%,間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)純度98%,二者均購自Sigma-Aldrich公司(密西根州圣路易斯,美國)。Trizol試劑、PrimeScript?RT reagent試劑盒和SYBR?Real-Time PCR Master購自TaKaRa公司(大連,中國)。氯仿、異戊醇和無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 斑馬魚飼養(yǎng)及TDCIPP暴露實驗

    實驗所用AB純系斑馬魚的養(yǎng)殖以及暴露實驗根據(jù)Yu等[34]提供的實驗方案實施。斑馬魚胚胎(野生型AB品系)購于中國科學院水生生物研究所。挑選發(fā)育正常的囊胚期胚胎(受精后2 h,2 hpf),隨機分配至含有0、3、30和300 ng·L-1TDCIPP暴露液的培養(yǎng)皿中,每個皿中放置100顆胚胎,每個濃度設置3個平行,所有暴露組DMSO濃度為0.001% (V/V)。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5 d后將孵化出的仔魚從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到魚房中25 L的魚缸內(nèi),每隔2天全部更換一次暴露液??刂扑疁胤€(wěn)定在(28±0.5) ℃,光照控制為14 h光照∶10 h黑暗,每日投喂2次豐年蟲。實驗中所投喂的豐年蟲均于實驗室中孵化,豐年蟲卵從天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司購得。從F0胚胎開始暴露,持續(xù)暴露3代(F0代、F1代和F2代),每一代暴露120 d,然后以1∶1的比例將雄魚和雌魚混在一起產(chǎn)卵,收集每一代的子代(F1代、F2代和F3代),于暴露液中持續(xù)培養(yǎng)至5 dpf,統(tǒng)計F1代、F2代和F3代胚胎/仔魚3 dpf的孵化率、5 dpf的存活率、5 dpf的畸形率和5 dpf的體長。

    1.3 斑馬魚仔魚運動行為分析

    斑馬魚仔魚的游泳行為的檢測參照筆者之前的實驗方法[20]。簡單的說,針對每一代斑馬魚仔魚(F1代、F2代和F3代),每個濃度每個平行缸取8尾仔魚進行游泳行為測定,采用ZebraLab行為圖像監(jiān)測器中Video-Track系統(tǒng)(View Point Life Sciences,蒙特利爾,加拿大)中的攝像頭記錄仔魚運動軌跡,從而分析獲得相關行為數(shù)據(jù),定量分析5 dpf仔魚的游泳行為。測定之前,先將斑馬魚放入裝有TDCIPP暴露液的12孔板中適應10 min,調(diào)節(jié)水溫保持在(28±0.5) ℃,每個孔中一條仔魚;然后進行40 min的光暗交替(5 min光照—5 min黑暗—5 min光照—5 min黑暗)刺激,每30秒采集一次仔魚運動頻率、行進距離和運動持續(xù)時間,試驗中保持安靜的環(huán)境。記錄的數(shù)據(jù)用在線Open Office.Org 2.4軟件分析。

    1.4 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)

    斑馬魚仔魚的神經(jīng)發(fā)育相關基因的檢測參照筆者之前的實驗方法[35]。對F1代、F2代和F3代120 hpf的斑馬魚仔魚進行神經(jīng)相關基因表達分析。每個平行缸隨機取50尾仔魚(n=3)置于Trizol中,根據(jù)筆者之前的方法[33]進行總RNA的提取,采用分光光度計檢測260/280比值來確定cDNA的合成。使用在線引物設計軟件Primer 3 software (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)進行設計,引物序列如表1所示。

    1.5 數(shù)據(jù)分析方法

    實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件(SPSS, Chicago, IL, USA)處理分析。首先采用Kolmogorov-Smirnov方法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗,對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換使其符合正態(tài)分布。然后采用Levene’檢驗方法進行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗。暴露組和對照組采用單因素方差分析方法(one-way analysis of variance, ANOVA)中Tukey’s多重比較法進行數(shù)據(jù)的差異性檢驗。結(jié)果表示為3次獨立重復試驗數(shù)據(jù)的算術平均值±標準差(mean±SD)。使用Spearman相關分析來檢驗仔魚在光暗刺激下的平均游泳速度和神經(jīng)發(fā)育相關基因表達之間的相關性,P<0.05為顯著性差異。

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 TDCIPP多代暴露對各自子代5 dpf仔魚存活率和孵化率的影響

    如表2所示,與對照組相比,經(jīng)環(huán)境劑量的TDCIPP (300 ng·L-1)暴露后,F(xiàn)0代斑馬魚的子代F1代的孵化率顯著性降低(P<0.05),5 dpf子代的存活率也顯著性下降(P<0.01)(表2),但其畸形率和體長無顯著性變化。隨著暴露代數(shù)的增加,與對照組相比,F(xiàn)2代和F3代仔魚的生長、存活率以及畸形率均無顯著性差異(表2)。

    2.2 TDCIPP多代暴露對各自子代5 dpf仔魚神經(jīng)行為的影響

    如圖1所示,在光暗周期刺激下,與對照組相比,在初始黑暗狀態(tài)下300 ng·L-1TDCIPP暴露組中F0代斑馬魚120 d后所產(chǎn)子代F1代仔魚的游泳速度顯著性降低(P<0.05);在處于光照環(huán)境中時,3和300 ng·L-1TDCIPP暴露組仔魚的游泳速度均顯著性下降(P<0.05、P<0.05);當環(huán)境再次處于黑暗周期時,最高劑量(300 ng·L-1)暴露導致子代仔魚的游泳速度顯著性下降(P<0.05)。

    表1 研究中的目的基因與引物序列Table 1 Genes and primers used in this study

    表2 環(huán)境劑量磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)多代暴露對F1代、F2代和F3代斑馬魚胚胎/仔魚的孵化率、畸形率、成活率和體長的影響Table 2 Effects of multigenerational exposure to tris (1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCIPP) at environmental concertation on the hatching rate, survival rate, malformation rate and body length of F1, F2 or F3 embryos/larvae

    注:數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(mean±SD),每個濃度3個平行樣,每個平行樣50條胚胎或仔魚。*P<0.05、**P<0.01表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。

    Note: The data are expressed as mean ±SD of three replicates (50 embryos/larvae per replicate); *P<0.05, **P<0.01 indicate significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

    如圖2所示,與對照組相比,300 ng·L-1TDCIPP暴露組中F1代120 d后所產(chǎn)子代F2代的游泳速度在黑暗刺激下顯著性降低(P<0.05),在光照周期下無顯著性差異。

    如圖3所示,與對照組相比,3、30和300 ng·L-1TDCIPP暴露組中F2代120 d后所產(chǎn)子代F3代的游泳速度在黑暗和光照刺激下均無顯著性變化。

    2.3 TDCIPP多代暴露對各自子代5 dpf仔魚神經(jīng)發(fā)育相關基因表達的影響

    檢測了F1代、F2代和F3代5 dpf仔魚在TDCIPP暴露下神經(jīng)細胞生長發(fā)育及分化相關的幾種基因的相對表達量(圖4)。如圖4(a),在F1代中,與對照組相比,300 ng·L-1TDCIPP暴露導致神經(jīng)元標志基因ngn1表達量顯著性升高(P<0.01),3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致神經(jīng)元軸突再生和發(fā)育相關的基因α1-tubulin顯著性上調(diào)(P<0.001、P<0.01),30 ng·L-1TDCIPP暴露導致刺激軸突生長的netrin1b基因顯著性上調(diào)(P<0.05),3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致運動神經(jīng)元軸突標志基因zn5顯著性上調(diào)(P<0.05,P<0.05),但星形膠質(zhì)細胞的標志基因gfap在300 ng·L-1TDCIPP暴露下顯著性下調(diào)(P<0.01)。

    圖1 F0代斑馬魚暴露于TDCIPP 120 d后對所產(chǎn)F1代5 dpf仔魚運動行為的影響注:(a)光暗周期刺激下斑馬魚仔魚的運動模式,(b)光暗周期刺激下的斑馬魚仔魚在各階段的平均游泳速率;數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(mean±SD),每個濃度3個平行樣,每個平行樣8條仔魚;* P<0.05表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。Fig. 1 Locomotor behavior of the 5 dpf larvae of F1 after F0 parental zebrafish exposed to TDCIPP for 120 dNote: (a) locomotor patterns in response to an alternating light change; (b) the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark); the data are expressed as mean±SD of three replicates (8 larvae per replicate); * P<0.05 indicates significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

    圖2 F1代斑馬魚暴露于TDCIPP 120 d后對所產(chǎn)F2代5 dpf仔魚運動行為的影響注:(a)光暗周期刺激下斑馬魚仔魚的運動模式,(b)光暗周期刺激下的斑馬魚仔魚在各階段的平均游泳速率;數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(mean±SD),每個濃度3個平行樣,每個平行樣8條仔魚;* P<0.05表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。Fig. 2 Locomotor behavior of the 5 dpf larvae of F2 after F1 parental zebrafish exposed to TDCIPP for 120 dNote: (a) locomotor patterns in response to an alternating light change; (b) the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark); the data are expressed as mean±SD of three replicates (8 larvae per replicate); * P<0.05 indicates significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

    圖3 F2代斑馬魚暴露于TDCIPP 120 d后對所產(chǎn)F3代5 dpf仔魚運動行為的影響注:(a)光暗周期刺激下斑馬魚仔魚的運動模式,(b)光暗周期刺激下的斑馬魚仔魚在各階段的平均游泳速率;數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(mean±SD),每個濃度3個平行樣,每個平行樣8條仔魚。Fig. 3 Locomotor behavior of the 5 dpf larvae of F3 after F2 parental zebrafish exposed to TDCIPP for 120 dNote: (a) locomotor patterns in response to an alternating light change; (b) the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark); the data are expressed as mean±SD of three replicates (8 larvae per replicate).

    如圖4(b)所示,在F2代中,與對照組相比,最高劑量TDCIPP (300 ng·L-1)暴露導致神經(jīng)元標志基因elavl3顯著性下調(diào)(P<0.05),與神經(jīng)元軸突生長和再生相關的標記基因gap43顯著性下調(diào)(P<0.05),30和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致shha基因顯著性下調(diào)(P<0.05、P<0.05),3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致gfap基因表達量顯著性下調(diào)(P<0.05、P<0.05)。但對其他基因的表達均無顯著性影響。

    如圖4(c)所示,在F3代中,與對照組比較,300 ng·L-1TDCIPP暴露導致gap43表達量顯著性下降(P<0.05),3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致gfap基因表達量顯著性下降(P<0.05、P<0.05),但對其他基因無顯著性影響。

    2.4 相關分析

    F1代、F2代和F3代5 dpf仔魚神經(jīng)發(fā)育相關基因表達的變化與各自游泳速度變化之間的相關性分析如表3所示。由Spearman相關性分析可知,F(xiàn)1代5 dpf仔魚在光暗刺激下的游泳速度與神經(jīng)元標記基因ngn1、神經(jīng)元軸突生長密切相關的基因α1-tubulin和運動神經(jīng)元標志基因zn5的表達顯著負相關。而F2代和F3代仔魚在光暗刺激下的游泳速度與神經(jīng)發(fā)育相關基因的表達都無顯著相關性。

    表3 F1代、F2代和F3代5 dpf仔魚在光暗刺激下的平均游泳速度與神經(jīng)發(fā)育相關基因表達的Spearman rank相關系數(shù)Table 3 Spearman rank correlation coefficients between the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark) and the expressions of genes related to neural development in the 5 dpf zebrafish larvae of F1, F2, F3

    注:*0.05水平的顯著相關(雙尾),** 0.01水平的顯著相關(雙尾)。

    Note: * correlation is significant at the 0.05 level (two-tailed); ** correlation is significant at the 0.01 level (two-tailed).

    圖4 環(huán)境劑量TDCIPP多代暴露對斑馬魚F1代(a)、F2代(b)和F3代(c)的5 dpf仔魚神經(jīng)發(fā)育相關基因的影響注:數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(mean±SD),每個濃度3個平行樣,每個平行樣50條仔魚;*P<0.05、** P<0.01和*** P<0.001表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。Fig. 4 Expressions of genes related to neural development in 5 dpf zebrafish larvae (F1 generation (a), F2 generation (b), F3 generation (c)) under multigenerational exposure to environmental concentration of TDCIPPNote: The data are expressed as mean±SD of three replicates (50 larvae per replicate); * P<0.05, ** P<0.01 and *** P<0.001 indicate significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

    3 討論(Discussion)

    TDCIPP作為一種新型污染物,經(jīng)常在自然水體中檢測到(<μg·L-1)。筆者所在團隊前期的研究結(jié)果表明,環(huán)境劑量的TDCIPP暴露,會導致TDCIPP在斑馬魚母體內(nèi)蓄積[36-37],并會傳遞到子代魚卵中[36]。此外,斑馬魚持續(xù)暴露于環(huán)境劑量的TDCIPP 2代后,會在第2代斑馬魚成魚體內(nèi)檢測到其蓄積[38]。目前,這些蓄積的TDCIPP是否會對斑馬魚子代持續(xù)產(chǎn)生不利影響還是未知的。早期發(fā)育階段對化合物暴露更為敏感,尤其是大腦發(fā)育階段[39],斑馬魚早期發(fā)育階段神經(jīng)系統(tǒng)中專一表達的一些基因已證實可以作為發(fā)育神經(jīng)毒性的生物標志[22]。此外,斑馬魚的游泳行為是在早期發(fā)育后期出現(xiàn)的一個較復雜的行為,需要化學遞質(zhì)傳遞和后腦神經(jīng)系統(tǒng)的輸出[40],仔魚的運動行為也可用于指示神經(jīng)毒性效應[41]。本實驗采用環(huán)境劑量TDCIPP對斑馬魚進行3代暴露實驗,探究其對子代斑馬魚仔魚生長發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育的影響,以此來評估TDCIPP的生態(tài)毒性風險效應。

    F0代暴露于環(huán)境劑量TDCIPP (300 ng·L-1) 120 d后所產(chǎn)子代F1代仔魚的孵化率和成活率均顯著性降低。這與筆者所在團隊前期的研究結(jié)果是類似的,斑馬魚暴露于5 000 ng·L-1TDCIPP 240 d導致子代仔魚的存活率下降、體長減小和生長發(fā)育受阻[36]。但在后面2代的持續(xù)暴露中,F(xiàn)2代和F3代仔魚的孵化率、存活率、畸形率以及體長均未受到顯著性影響,這些結(jié)果表明,隨著暴露代數(shù)的增加,TDCIPP對子代斑馬魚的發(fā)育毒性減弱。

    環(huán)境劑量TDCIPP多代暴露對子代斑馬魚仔魚F1代和F2代的游泳行為具有顯著抑制作用,但是對F3代的游泳行為無顯著性影響。目前,有關環(huán)境劑量TDCIPP多代暴露對生物體影響的研究非常少,而其對神經(jīng)行為的影響更是鮮有報道。在筆者的實驗中,300 ng·L-1TDCIPP暴露導致F1代仔魚在黑暗刺激下的游泳速度均顯著性下降,暴露于3和300 ng·L-1TDCIPP的F1代仔魚在光照刺激下的行為也顯著性下降。類似的結(jié)果在之前的研究中也有報道,Wang等[16]將斑馬魚暴露于100 μg·L-1TDCIPP 3個月后,成魚的運動行為未受到顯著性影響,但所產(chǎn)子代仔魚的平均游泳速率在光照和黑暗下均顯著性下降。此外,筆者所在團隊前期的實驗結(jié)果表明,較高劑量TDCIPP (>300 μg·L-1)短期暴露會導致斑馬魚仔魚的游泳行為在最初黑暗適應期的活動有所增加,而在光照時反應有所減弱[20],而濃度>100 μg·L-1的TDCIPP暴露不會影響仔魚的游泳行為[16,20]。在13 μg·L-1的TDCIPP暴露下,仔魚在最初黑暗適應期的活動有所增加,而逃逸反應有所減弱[42]。而有研究發(fā)現(xiàn),暴露于較高濃度(1.353和2.413 mg·L-1;3和6 μmol·L-1)TDCIPP下,在光照和黑暗2種條件下斑馬魚仔魚的游泳速度均顯著性降低[17,21]。這些研究結(jié)果表明,TDCIPP暴露對斑馬魚仔魚的游泳行為具有顯著的干擾效應,且母體TDCIPP暴露后的F1代仔魚比F0代成魚和仔魚都要敏感。對F2代仔魚,300 ng·L-1TDCIPP暴露導致在黑暗下的斑馬魚仔魚游泳速率顯著性下降,但在光照刺激下其運動速度無顯著性變化。但到F3代仔魚時,TDCIPP的持續(xù)暴露未引起斑馬魚的游泳行為的顯著性變化。結(jié)果表明,環(huán)境劑量的TDCIPP暴露會導致F1代仔魚的神經(jīng)發(fā)育毒性,但是TDCIPP持續(xù)多代暴露并未導致毒性的增強,反而隨著暴露代數(shù)的增加,斑馬魚仔魚對TDCIPP的敏感性呈現(xiàn)降低的趨勢。

    有研究表明,斑馬魚運動行為的改變與運動神經(jīng)元的發(fā)育受影響相關[43-44]。為探究TDCIPP可能的神經(jīng)發(fā)育毒性機制,分析了仔魚神經(jīng)相關基因的轉(zhuǎn)錄水平,并將其與運動行為進行了相關性分析。在F1代仔魚中,神經(jīng)元標記基因ngn1表達量顯著性升高,與神經(jīng)元軸突生長密切相關的基因α1-tubulin、netrin1b和zn5顯著性上調(diào),這些基因表達的上調(diào)可能是對神經(jīng)元軸突損傷的一個補償性反饋。在之前的研究中,α1-tubulin表達量的上調(diào)被認為是對化學品暴露后斑馬魚仔魚軸突生長受到的抑制作用的補償性反饋(如得克隆(DP)和2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)暴露實驗)[43-44]。實際上,在筆者所在團隊的前期實驗中也發(fā)現(xiàn),TDCIPP急性暴露會導致運動神經(jīng)元軸突的損傷,并伴隨著軸突生長相關基因α1-tubulin、netrin表達量的上調(diào)[20]。環(huán)境劑量TDCIPP暴露主要影響了F1代神經(jīng)元和軸突生長相關基因的表達,而對神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿酶活基因(acetylcholinesterase,ache)、髓磷脂堿性蛋白基因(myelin basic protein,mbp)等均無顯著性影響,相關性分析顯示,游泳速度的抑制與ngn1、α1-tubulin、gap43和zn5這4個基因的表達顯著負相關,這些結(jié)果表明,TDCIPP可能主要通過影響神經(jīng)元軸突的生長來導致游泳行為受阻,這與前期的實驗結(jié)果類似[20]。在F2代斑馬魚仔魚中,TDCIPP暴露導致神經(jīng)元標志基因elavl3(編碼HuC)表達量顯著性下調(diào),表明神經(jīng)發(fā)育受到了損傷。生長相關蛋白gap43基因的表達量也顯著性降低,gap43常常用作神經(jīng)損傷后再生時重新誘導軸突生長的標志[20],該基因的下調(diào)表明受損神經(jīng)的再生受到了影響。此外,星形膠質(zhì)細胞標記基因gfap以及連接視網(wǎng)膜和脊髓間的軸突索基因shha均顯著性下降。這些基因表達的下調(diào)表明TDCIPP暴露可能對神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的數(shù)量和再生均產(chǎn)生了影響,表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)發(fā)育毒性。然而,相關性分析表明,F(xiàn)2代仔魚游泳速度的降低與這些基因表達的下降無顯著相關性,提示TDCIPP可能不是通過影響神經(jīng)細胞的數(shù)量而影響魚的游泳行為。在F3代中,僅gap43和gfap這2個基因的表達量受到TDCIPP暴露的抑制,表明隨著暴露代數(shù)的增加,TDCIPP的神經(jīng)發(fā)育毒性在減弱,這與游泳行為以及生長發(fā)育的結(jié)果是一致的。

    綜上所述,環(huán)境劑量TDCIPP暴露對斑馬魚子代仔魚具有神經(jīng)發(fā)育毒性,但是隨著暴露代數(shù)的增加TDCIPP的毒性效應呈現(xiàn)減弱的趨勢。TDCIPP暴露導致F0代所產(chǎn)F1代仔魚的生長發(fā)育以及運動行為受到顯著的抑制,其對運動速度的影響可能主要源于神經(jīng)元軸突的生長受到了影響,表現(xiàn)為運動行為抑制與神經(jīng)軸突生長相關基因(ngn1、α1-tubulin和zn5)的表達量顯著負相關。繼續(xù)暴露后,F(xiàn)2代仔魚的生長發(fā)育不再受到顯著性影響,運動行為僅在最高劑量組黑暗處理下受到抑制,神經(jīng)發(fā)育相關基因(elavl3、gap43、gfap和shha)表達量顯著下降,但運動的抑制與基因表達無顯著相關性。暴露至F3代仔魚,其生長發(fā)育和神經(jīng)行為均不再受影響,僅gap43和gfap這2個基因表達量下調(diào)。表明隨著暴露代數(shù)的增加,TDCIPP的神經(jīng)發(fā)育毒性效應降低。筆者首次研究了生物體多代處于環(huán)境劑量TDCIPP暴露后的毒性效應,為TDCIPP的生態(tài)風險評價提供了理論依據(jù)。在進一步的研究中,將結(jié)合化學分析和分子生物學手段,開展深層次的研究,力圖從化合物在生物體內(nèi)的蓄積、代謝以及生物體的解毒代謝等多方面來揭示TDCIPP多代持續(xù)暴露后毒性減弱的機制。

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