堿性體系下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

朱龍杰，張 華，吳 洋，陳晶波，曹 毅，廖惠云，王 瑞，朱懷遠(yuǎn)，沈曉晨，毛淑蕊

江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南京市興隆大街29 號(hào) 210019

美拉德反應(yīng)是由氨基酸和還原糖或其他羰基化合物之間發(fā)生的一系列反應(yīng)的總稱，反應(yīng)產(chǎn)物具有一定風(fēng)格及香味特征，很多具有自然優(yōu)美、令人愉悅的香氣，同時(shí)還含有還原酮等活性物質(zhì)，具有抗氧化抗自由基能力，因此美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在香料、食品、煙草、制藥等領(lǐng)域均有重要應(yīng)用［1-7］。關(guān)于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的研究，主要集中在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)理研究、反應(yīng)條件優(yōu)化、產(chǎn)物的檢測(cè)分析、香氣的感官評(píng)價(jià)及加香應(yīng)用等方面［8-20］。

對(duì)于美拉德反應(yīng)的研究，前人主要集中在反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、體系水分、體系pH 等反應(yīng)條件的優(yōu)化研究方面［9-13］。一般認(rèn)為反應(yīng)體系pH 升高，會(huì)促進(jìn)美拉德反應(yīng)進(jìn)行［13］。但是文獻(xiàn)［21-22］報(bào)道，隨美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，初始呈堿性的美拉德反應(yīng)液會(huì)迅速地變?yōu)樗嵝?。盡管這種現(xiàn)象在一些研究中被較多提及，但相應(yīng)的維持堿性條件的探索嘗試卻較少，也未有比較不同堿性體系下美拉德反應(yīng)體系pH 變化的研究。而對(duì)于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要成分的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析，還較多地停留在定性階段［10-11，14-17］，開展美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香味物質(zhì)定量的工作較少，且少數(shù)定量研究一般只選擇某些特定的美拉德產(chǎn)物進(jìn)行分析［12，18］，鮮見有全面開展針對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味物質(zhì)種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。此外，對(duì)于一些只選擇少數(shù)幾種糖和氨基酸為原料制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物并進(jìn)行檢測(cè)分析或應(yīng)用的研究［17-20］，由于此類方法沒有完整地研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，因此難以深入探討美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中香味物質(zhì)的形成機(jī)制，也無法系統(tǒng)獲知美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中香味物質(zhì)種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分布規(guī)律。

本研究中以不同糖類和氨基酸的反應(yīng)產(chǎn)物為研究對(duì)象，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立合適的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備方法，研究不同糖類和氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并重點(diǎn)分析了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中香味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分布規(guī)律，旨在為香料和食品行業(yè)等準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和應(yīng)用美拉德反應(yīng)產(chǎn)物提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-脫氧核糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-半胱氨酸（BR），氫氧化鈉、碳酸鉀、丙二醇（AR）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；丙酸苯乙酯（＞97%，阿法埃莎化學(xué)有限公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

ME203 電子天平（感量0.001 g）、S210 型pH 計(jì)（分 辨 率0.001）（瑞 士Mettler Toledo 公 司）；ZNCL-G 型智能恒溫磁力攪拌器（河南愛博特科技發(fā)展有限公司）；R215 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Büchi 公司）；6890N-5975C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；0.22 μm 有機(jī)相濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

稱取5 mmol 糖和5 mmol 氨基酸，加入50 mL圓底燒瓶中，再加入2.5 mmol 碳酸鉀（當(dāng)氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸時(shí)，碳酸鉀的量為5 mmol）使反應(yīng)液的pH 維持在9～10。以20 mL 丙二醇和5 mL 超純水的混合液作為反應(yīng)溶劑，升溫加熱至100 ℃，反應(yīng)6 h。

1.2.2 兩種美拉德反應(yīng)體系下pH 的檢測(cè)

校正pH 計(jì)，使測(cè)量范圍為pH 3.00～10.00，采用兩種方法對(duì)美拉德反應(yīng)體系pH 的變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)：一種方法是采用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液初始pH 至9～10，然后加入同一糖類和不同氨基酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)；另一種方法是根據(jù)同一糖類和不同氨基酸的物質(zhì)的量，加入一定量的碳酸鉀使反應(yīng)液的pH 至9～10 后進(jìn)行美拉德反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用pH 計(jì)檢測(cè)反應(yīng)液的pH。

1.2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中香味成分的GC-MS 檢測(cè)與分析

取2 mL 美拉德反應(yīng)液加入分液漏斗中，加入100 μL 內(nèi)標(biāo)濃度為1 mg/mL 的丙酸苯乙酯二氯甲烷溶液和15 mL 超純水，用二氯甲烷（20 mL×2）萃取。合并有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥。過濾后，將濾液減壓濃縮至1 mL，過0.22 μm 有機(jī)相濾膜，采用GC-MS 法進(jìn)行分析。分析條件：

色譜柱：Agilent DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；載氣：He；載氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10 ∶1；升 溫 程序：60 ℃（1 min）10 ℃/min 280 ℃（15 min）；傳輸線溫度：280 ℃；MS 電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：30～450 amu；溶劑延遲：3 min。

采用Nist14 和Wiley 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫檢索定性，以匹配度≥85%認(rèn)為可信。以添加的丙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，假定檢出的香味物質(zhì)校正因子為1，回收率為100%，利用公式（1）計(jì)算美拉德反應(yīng)產(chǎn)物樣品中某一待測(cè)香味成分的質(zhì)量，利用公式（2）計(jì)算美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中香味成分的總質(zhì)量。

其中：Mi—待測(cè)香味成分的質(zhì)量；Ms—內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量；Ai—待測(cè)香味成分的峰面積；As—內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積；MT—美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中香味成分總質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種美拉德反應(yīng)體系中pH 的變化對(duì)比

為了對(duì)比使用氫氧化鈉和碳酸鉀對(duì)維持美拉德反應(yīng)體系pH 的效果，選擇以葡萄糖和不同氨基酸為原料進(jìn)行美拉德反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)每種氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)液的pH，結(jié)果如表1所示?？芍?，當(dāng)采用氫氧化鈉時(shí)，美拉德反應(yīng)末期反應(yīng)液的pH 幾乎均從堿性變?yōu)樗嵝?。其原因可能是由于美拉德反?yīng)體系中不斷地生成酸性物質(zhì)，中和了體系的堿性，并且有些氨基酸的pKa值較低，也會(huì)促進(jìn)反應(yīng)體系pH 轉(zhuǎn)為酸性，因此采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)美拉德反應(yīng)液初始pH 為堿性的方法難以真正維持反應(yīng)液體系為堿性。當(dāng)采用碳酸鉀時(shí)，美拉德反應(yīng)末期反應(yīng)液的pH 均能維持在堿性。原因可能是由于碳酸鉀為中等堿性物質(zhì)并能起到持續(xù)中和作用，且可以根據(jù)原料的量按照一定比例添加而不會(huì)造成反應(yīng)液的堿性過強(qiáng)。隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，生成的酸性物質(zhì)不斷被中和，但只要碳酸鉀的量足夠，溶液就會(huì)維持堿性環(huán)境，美拉德反應(yīng)將不會(huì)受到抑制。因此，采用定量添加碳酸鉀的方法可以有效維持美拉德反應(yīng)在堿性環(huán)境下進(jìn)行，比添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)液初始pH為堿性的方法更能有效地促進(jìn)美拉德反應(yīng)。

2.2 4 種糖類與多種氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的鑒定

在美拉德反應(yīng)糖類原料中，最常見的為五碳糖和六碳糖，其中有不少物理和化學(xué)性質(zhì)相似的異構(gòu)體。由于異構(gòu)體糖類的反應(yīng)活性和反應(yīng)產(chǎn)物較為接近，因此選擇兩兩非異構(gòu)體葡萄糖、果糖、木糖和脫氧核糖作為美拉德反應(yīng)的糖原料。將葡萄糖、果糖、木糖和脫氧核糖分別與20 種氨基酸進(jìn)行兩兩組合反應(yīng)，共得到80 種美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物。

對(duì)80 種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS 定性分析，鑒定出的主要成分有雜環(huán)類、芳香族類、烯酮（醛）類、醇類、醚類、大分子脂肪族化合物等。其中，雜環(huán)類、芳香族類和烯酮（醛）類化合物具有典型香氣特征［23-26］。由于以上3 大類物質(zhì)的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較多且具有香味化合物相似的特征分子骨架，因此選定雜環(huán)類、苯環(huán)類和烯酮（醛）類化合物作為關(guān)鍵香味成分研究對(duì)象，其中雜環(huán)類化合物包括氮雜環(huán)、氧雜環(huán)和硫雜環(huán)3種。

表1 葡萄糖美拉德反應(yīng)末期反應(yīng)液pH 對(duì)比Tab.1 Solution pH values at the end of Maillard reaction by glucose

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)出的含氮雜環(huán)化合物是種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)最豐富的化合物，主要有吡咯類（10 種）、吡啶類（6 種）、吡嗪類（32 種）。含氮雜環(huán)類化合物存在于絕大多數(shù)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，經(jīng)鑒定出的氮雜環(huán)化合物共有48 種，其分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)出的含氧雜環(huán)化合物種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)不多，主要有呋喃類（3 種）、呋喃酮類（1 種）和麥芽酚類化合物（1種），主要存在于葡萄糖和果糖類美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)出的含硫雜環(huán)化合物種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)很少，僅有噻唑類1 種，只存在于半胱氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中。經(jīng)鑒定出的含氧雜環(huán)和含硫雜環(huán)化合物共有6 種，其分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，檢測(cè)出的芳香族類化合物種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，主要為醇類化合物（2 種）、醛類化合物（2 種）、酮類化合物（1 種），主要存在于含苯環(huán)的氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，經(jīng)鑒定出的芳香族類化合物共有4 種，其分子結(jié)構(gòu)如圖3 所示。在制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，檢測(cè)出的烯酮（醛）類化合物種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)較豐富，主要為開鏈烯酮（醛）類（3 種）和閉環(huán)烯酮類（3種）化合物，主要存在于亮氨酸和異亮氨酸等特定的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，經(jīng)鑒定出的烯酮（醛）類化合物共有6 種，其分子結(jié)構(gòu)如圖4 所示。

圖1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的含氮雜環(huán)化合物Fig.1 Structures of nitrogen-containing heterocyclic compounds produced by Maillard reaction

圖2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的含氧和含硫雜環(huán)化合物Fig.2 Structures of oxygen-and sulfur-containing heterocyclic compounds produced by Maillard reaction

圖3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的芳香族類化合物Fig.3 Structures of aromatic compounds produced by Maillard reaction

圖4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的烯酮（醛）類化合物Fig.4 Structures of ketene and enal compounds produced by Maillard reaction

2.3 4 種糖類與多種氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的總質(zhì)量

對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物譜圖中的所有成分先逐一進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性，再選擇美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的雜環(huán)類、芳香族類、烯酮（醛）類化合物3 大類關(guān)鍵香味成分進(jìn)行定量分析，最后根據(jù)公式（1）和公式（2）計(jì)算得到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中80 種關(guān)鍵香味成分的總質(zhì)量，結(jié)果見表2。

表2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的總質(zhì)量①Tab.2 Total contents of key aroma components in Maillard reaction products （mg）

表2 中除列出了每個(gè)美拉德反應(yīng)對(duì)應(yīng)產(chǎn)物中香味物質(zhì)的總質(zhì)量，還分別橫向和縱向統(tǒng)計(jì)了4種糖類和同一種氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量之和以及不同氨基酸與同一糖類美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量之和，用于輔助分析糖類和氨基酸的反應(yīng)活性以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分質(zhì)量大小的內(nèi)在規(guī)律。在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量之和的橫向比較中，4 種糖類的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香味成分總量為果糖＞＞木糖＞葡萄糖＞脫氧核糖。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量之和的縱向比較結(jié)果表明，不同氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物關(guān)鍵香味成分質(zhì)量差別較為明顯，按照質(zhì)量多少將其分為3 個(gè)檔次：第一檔總質(zhì)量ΣMT≥30 mg，對(duì)應(yīng)的4 種氨基酸原料分別為亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；第二檔總質(zhì)量10 mg≤ΣMT＜30 mg，對(duì)應(yīng)的9 種氨基酸原料分別為丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、組氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸；第三檔總質(zhì)量ΣMT＜10 mg，對(duì)應(yīng)的7 種氨基酸原料分別為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。

2.4 糖類和氨基酸影響美拉德反應(yīng)中關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量的機(jī)制探討

根據(jù)文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道，不同的糖原料進(jìn)行美拉德反應(yīng)活性大小的順序是木糖＞核糖＞阿拉伯糖＞山梨糖＞葡萄糖＞果糖，其中五碳糖的反應(yīng)活性高于六碳糖，葡萄糖的反應(yīng)活性高于果糖。盡管糖類的反應(yīng)活性大小可以通過反應(yīng)液色澤及吸光度判斷，但美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的生成情況還需進(jìn)一步通過檢測(cè)分析進(jìn)行判斷。從表2 可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的總質(zhì)量與糖類的反應(yīng)活性并不正相關(guān)。其原因在于，美拉德反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)體系，一些香味成分的產(chǎn)生與糖類的分子結(jié)構(gòu)和反應(yīng)中間體構(gòu)型緊密關(guān)聯(lián)［14］。在反應(yīng)中，如果產(chǎn)生的中間體結(jié)構(gòu)不利于香味成分分子結(jié)構(gòu)的生成，那么最終得到的香味成分總質(zhì)量就會(huì)減少，如一些重要的雜環(huán)類化合物。

由于吡嗪類氮雜環(huán)化合物在多種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香味成分中占主導(dǎo)地位，故可對(duì)吡嗪類香味成分的形成機(jī)制進(jìn)行重點(diǎn)分析。根據(jù)本研究的數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)中有關(guān)美拉德反應(yīng)中間體的研究結(jié)果［27-30］，分析了糖類在美拉德反應(yīng)中形成吡嗪類化合物的反應(yīng)機(jī)制，其重要中間體二羰基化合物的反應(yīng)路線如圖5 所示。首先，果糖先與氨基酸生成果糖胺，然后果糖胺經(jīng)過一系列Heyenes 重排、1,2-重排反應(yīng)和脫氨基后生成活潑性高且更容易進(jìn)行反應(yīng)的含醛基的二羰基化合物，接著二羰基化合物與氨基酸作用進(jìn)行Strecker 降解生成活潑的氨基酮，最后氨基酮之間縮合生成吡嗪類雜環(huán)化合物。而由葡萄糖生成的葡萄糖胺經(jīng)過Amadori 重排、2,3-重排反應(yīng)和脫氨基后生成含酮基的二羰基類化合物，該類二羰基化合物由于反應(yīng)活性較低，繼續(xù)反應(yīng)生成吡嗪類雜環(huán)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少。因此，盡管果糖是酮糖，葡萄糖、木糖、脫氧核糖是醛糖，且初期生產(chǎn)糖胺的活性順序是醛糖大于酮糖，但在后期通過中間體二羰基化合物生成氨基酮的容易程度卻是酮糖大于醛糖。因此以果糖為原料的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中吡嗪類關(guān)鍵香味成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

圖5 葡萄糖和果糖美拉德反應(yīng)中二羰基化合物的生成機(jī)制［27-30］Fig.5 Formation mechanisms of dicarbonyl compounds formed in Maillard reactions by glucose and fructose

美拉德反應(yīng)中另一主要原料氨基酸由于取代基R 的不同，造成氨基酸的物理性質(zhì)和化學(xué)活性各不相同，對(duì)美拉德反應(yīng)中香味物質(zhì)的生成也有較大影響。從不同氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分的總質(zhì)量比較中可以看出，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量較小的氨基酸有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①R 的碳鏈太短（甘氨酸）或太長(zhǎng)（精氨酸）；②R 中含有羥基或巰基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）；③氨基酸分子中可形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)（脯氨酸）。這些氨基酸分子的空間結(jié)構(gòu)和反應(yīng)活性或許是美拉德反應(yīng)中一些重要中間體形成的不利因素，影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中一些關(guān)鍵香味成分的生成，造成關(guān)鍵香味成分的總質(zhì)量偏低。

3 結(jié)論

①建立了堿性體系的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備方法。②對(duì)所制備的80 種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS 定性分析，共鑒定出含氮雜環(huán)化合物48種，含氧雜環(huán)化合物5 種，含硫雜環(huán)化合物1 種，芳香族類化合物4 種，烯酮（醛）類化合物6 種。③在眾多關(guān)鍵香味成分中，含氮雜環(huán)化合物種類多、質(zhì)量分?jǐn)?shù)大，存在于絕大多數(shù)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中；含氧雜環(huán)化合物種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，主要存在于葡萄糖和果糖類美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中；含硫雜環(huán)化合物種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)很少，只存在于半胱氨酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中；芳香族類化合物和烯酮（醛）類化合物種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較少，存在于一些特定氨基酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中。④糖類美拉德反應(yīng)產(chǎn)物關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量大小為果糖＞＞木糖＞葡萄糖＞脫氧核糖。⑤不同氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中關(guān)鍵香味成分總質(zhì)量差別明顯，其中總質(zhì)量較高的氨基酸有亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。