煙草NtGT-2 基因的克隆及表達分析

趙利杰，鄭 美，王 中，謝小東，羅朝鵬，李宏光，武明珠*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001 2.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南省郴州市北湖區(qū)燕泉北路 423000

Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一類重要轉(zhuǎn)錄因子［1］。Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子含有保守的三螺旋結(jié)構(gòu)域［2-3］，該結(jié)構(gòu)域能特異性地與基因啟動子區(qū)域的GT 元件發(fā)生特異性結(jié)合，所以又稱為GT 因子［4-6］。Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合域富含堿性、酸性氨基酸，并有3 個串聯(lián)的α-螺旋結(jié)構(gòu)域，能夠形成螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋的構(gòu)象，這種構(gòu)象通常以1 個或2 個的形式存在于Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸結(jié)構(gòu)的N 端和C 端［7］。根據(jù)Trihelix轉(zhuǎn)錄因子家族保守域的結(jié)構(gòu)特征可將其家族分為5 個亞家族：GT-1、GT-2、GTγ、SH4 以及SIP1［8］。研究發(fā)現(xiàn)Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子家族在擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中有30 個成員［9］，在水稻（Oryza sativa L.）中有31 個成員［10］，在大豆（Glycine max(Linn.)Merr.）中有11 個成員［11］，在辣椒（Capsicum annuum L.）中有28 個成員［12］。

Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子不僅參與光應(yīng)答反應(yīng)［13］，也參與植物生長發(fā)育的多個過程，包括植物早期胚胎的建成［14-15］、氣孔和表皮毛的形成［16-17］、種子離層［18］、花器官的形成等［19-20］。另外，Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子在抵御生物（細菌病原體）和非生物脅迫（干旱、低溫和鹽脅迫）中也具有重要作用［21］。例如：用丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000（PsD）對擬南芥進行30 min 的脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)AtGT-3b 的轉(zhuǎn)錄迅速增加［22］；大豆的GmGT-2A 和GmGT-2B 基因轉(zhuǎn)到擬南芥中可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽、低溫和干旱脅迫的耐受性［23］；白楊PtaGTL1 可以通過調(diào)節(jié)氣孔密度影響蒸騰作用，進而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性［24］；在擬南芥的基因組中鑒定出一個受低溫脅迫、鹽脅迫和ABA 誘導(dǎo)的GT 因子AtGT2L，該蛋白在應(yīng)對非生物脅迫過程中具有重要作用［25］。

煙草（Nicotiana tabacum）作為一種重要的經(jīng)濟作物和模式植物，目前關(guān)于其Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。為此，在普通煙草K326 中克隆出一個Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子NtGT-2 基因，對該基因進行相關(guān)生物信息學(xué)分析，并分析NtGT-2 基因在煙草不同組織中的表達情況，以及在植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）、高鹽（200 mmol/L NaCl）、低溫（4 ℃）及聚乙二醇6000（Polyethylene Glycol，PEG）脅迫處理后的表達情況。旨在為揭示該基因的功能及煙草抗逆性品種改良提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 煙草材料

普通煙草（Nicotiana tab acum）品種K326 栽培于國家煙草基因研究中心的人工氣候溫室，采集盛花期第5（成熟葉）、第15 葉位葉片（幼葉）、莖稈、莖節(jié)、側(cè)根、須根、花、花蕾及腋芽，液氮速凍后在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

K326 的種子經(jīng)10%NaClO 消毒后播種于無菌培養(yǎng)瓶中（二分之一MS 培養(yǎng)基+1.5%瓊脂），待幼苗長至5～6 片真葉時將幼苗移植到去離子水中培養(yǎng)1 d，挑選長勢一致的幼苗分別進行PEG6000（15%）、低溫（4 ℃）、200 mmol/L NaCl和10 μmol/L ABA水培處理，在處理0、1、3、6、12 和24 h 后取樣，每個處理設(shè)置3 個獨立重復(fù)，每個重復(fù)取3 株長勢一致的煙苗，經(jīng)液氮速凍后在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 煙草總RNA 的提取和cDNA 合成

使用ExPro 煙草RNA 提取試劑盒（北京密碼子生物科技有限公司）提取煙草總RNA，并使用DNase I 柱上消化試劑盒(RNase free)去除DNA，具體流程參照試劑盒說明書。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］測定RNA 含量，計算A260/A280、A260/A230值，同時測定RNA 的完整性。選擇完整性較好和純度較高的總RNA 進行cDNA 的合成，反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］的說明書進行。

1.3 煙草NtGT-2 基因全長克隆

根 據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 番 茄SlGT2 的基因序列，在中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫（www.tobaccodb.org）中進行搜索，對得到的相似性最高的基因用Primer Premier 6 設(shè)計引物，上游引物NtGT-2-C-F：5'-ATGGAACTCCTCACTGAC-3'，下 游引物NtGT-2-C-R：5'-TTCTGTCTCACTCTTCACA-3'，并由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為20μL，包括2 μL cDNA、上下游引物各1 μL、6 μL ddH2O、10 μL PremixTaq。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60～90 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

對PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］對目的片段進行切膠回收，將純化回收的產(chǎn)物連接到pClone007 載體上（北京擎科生物科技有限公司），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α（上海生工生物工程有限公司），涂板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜，挑取單菌落，37 ℃搖床搖菌5 h 左右（200 r/min），以2 μL 菌液為模板進行PCR驗證是否為陽性克隆。將驗證出含有目的片段的菌液送由北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.4 煙草NtGT-2 蛋白生物信息學(xué)分析

使用ORF（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線軟件將煙草的NtGT-2 序列翻譯成氨基酸序列；ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析NtGT-2 蛋白中各種氨基酸含量、理論分子量和 等電點；Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）對NtGT-2 蛋白的親、疏水性進行分析；PSORT（https://www.genscript.com/psort.html）分 析NtGT-2蛋白細胞核定位信息；SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽，SMART 在線分析軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析NtGT-2 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；用PSIPRED 軟件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù) 測NtGT-2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測NtGT-2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型；用NCBI Blast 在線工具進行核酸及氨基酸序列的同源性比對，搜索并下載相關(guān)序列；用DNAMAN 軟件對NtGT-2 蛋白序列進行氨基酸序列多重比對分析；使用 MEGA 7.0 軟件，運用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）對蛋白序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 煙草NtGT-2 基因表達分析

采用實時熒光定量PCR 技術(shù)分析NtGT-2 基因的相對表達量。根據(jù)基因克隆得到的NtGT-2基因序列設(shè)計熒光定量PCR 引物，上游引物NtGT-2-q-F：5'-TCATCCAGCCTCCGTTAT-3'，下游引物NtGT-2-q-R：5'-TCATCAGAGTCTCGTCCAT-3'；以煙草的L25 基因為內(nèi)參基因，上游引物L(fēng)25-q-F：5'-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3'，下 游 引 物L(fēng)25-q-R：5'-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3'。定量PCR 所用儀器為Bio-Rad CFX96（美國伯樂公司），每個生物學(xué)樣品3 次獨立重復(fù)。反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物各1 μL，50 ng 的cDNA，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的CT值，用2-△△CT方法計算相對表達量［26］。以盛花期的成熟葉和不同處理的0 h 的相對表達量為1，基因的相對表達量為該基因與對照處理組的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtGT-2 基因克隆

以煙草幼苗的cDNA 為模板，通過設(shè)計的特異引物進行PCR 擴增，得到1 條長度約為1 300 bp 左右的條帶（圖1）。將切膠回收純化后的PCR 產(chǎn)物進行測序，測序得到的CDS 序列全長為1 176 bp，共編碼391 個氨基酸。

圖1 NtGT-2 基因的PCR 電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of NtGT-2

2.2 煙草NtGT-2 生物信息學(xué)分析

NtGT-2 基因與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）和水稻（Oryza sativa L.）的GT-2 核苷酸序列相似性較低，其相似度分別為32.97%、34.75%和30.87%。NtGT-2 基因與茄科植物的GT-2序列相似性較高，與辣椒（Capsicum annuum L.）、番茄（Solanum lycopersicum）和 馬 鈴 薯（Solanum tuberosum L.）的GT-2 序列相似度分別為87.89%、87.80%和87.64%。因此把該基因命名為NtGT-2。

利用MEGA 7.0 軟件對不同物種氨基酸序列進行比對，并采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，NtGT-2 與擬南芥（AtGT-2，AtDF1-like，AtGTL1，AtPTL，AtGT2L）、大 豆（GmGT-2A，GmGT-2B）和豌豆的PsDF1 等GT-2 亞家族成員親緣關(guān)系較近，在進化上都屬于GT-2 家族分支，證明NtGT-2 屬于GT-2 亞家族成員（圖2）。利用DNAMAN 軟件對煙草（NtGT-2）、土豆（StGT-2）、番茄（SlGT-2）、野生番茄（SpGT-2L）、棗（ZjGT-2）、擬 南 芥（AtGT-2L、AtGTL1 和AtGT2L）、大 豆（GmGT-2A）、水稻（OsGT-2）和豌豆（PsDF1）蛋白的C 端Trihelix 保守結(jié)構(gòu)域進行比對分析，結(jié)果顯示，不同物種的Trihelix 保守結(jié)構(gòu)域具有高度相似性，且NtGT-2 的Trihelix 保守結(jié)構(gòu)域符合GT-2 亞家族DNA結(jié)合域螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋的特點，進一步表明NtGT-2蛋白屬于GT-2亞家族成員（圖3）。

圖2 植物Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進化樹Fig.2 Evolutionary tree of amino acid sequences of Trihelix transcription factors from different plants

圖3 煙草NtGT-2 蛋白與其他物種GT-2 蛋白多重序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of tobacco NtGT-2 protein and GT-2 protein of other species

用ProtParam 在線軟件對煙草NtGT-2 蛋白的氨基酸序列進行分析，結(jié)果顯示，該蛋白預(yù)測分子量為45.01 kDa，等電點為5.80。富含極性氨基酸（Ser、Thr、Lys、Tyr 等151 個）和 疏 水 性 氨 基 酸（Thr、Trp、Phe、Val、Lue、Ala 等123 個）。預(yù)測蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為65.54%，表明NtGT-2 蛋白不穩(wěn)定。用Protscale 在線分析軟件對該蛋白的親疏水性進行預(yù)測，結(jié)果顯示，親水值絕對值最大為4.189，疏水值絕對值最大為1.633，疏水區(qū)域大于親水區(qū)域，推測該蛋白為疏水性蛋白。用PSORT在線分析軟件對NtGT-2 蛋白序列進行細胞定位預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白定位于細胞核中。

蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，NtGT-2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由螺旋和無規(guī)則卷曲組成，具有典型的螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋的構(gòu)象（圖4），符合Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白二級結(jié)構(gòu)特征。用SMART 預(yù)測NtGT-2 的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白C 端含有一個Trihelix 保守結(jié)構(gòu)域（SANT 結(jié)構(gòu)域），此外該蛋白還含有一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（Coiled-coil結(jié)構(gòu)域）。SWISS-MODEL 預(yù)測NtGT-2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，并以擬南芥GT-1 結(jié)構(gòu)為模型構(gòu)建了NtGT-2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖（圖5）。

圖4 NtGT-2 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of NtGT-2 protein

圖5 NtGT-2 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of tertiary structure of NtGT-2 protein

2.3 煙草NtGT-2 基因表達分析

利用實時熒光定量PCR 分析NtGT-2 基因在煙草盛花期不同組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)NtGT-2 基因在不同組織中均有表達，在莖節(jié)、莖稈及腋芽中的表達量較高，在花和花蕾中表達量次之，在葉片（幼葉，成熟葉）和根（側(cè)根，須根）中的表達量最低（圖6），可見NtGT-2 基因具有組織表達差異性。

煙草NtGT-2 基因在ABA 和各種脅迫處理不同時間的實時熒光定量PCR 結(jié)果表明，ABA 處理后NtGT-2 基因表達呈先上升后下降再上升的趨勢，ABA 在1、6 及12 h 可顯著誘導(dǎo)NtGT-2 基因表達（圖7 A）。在200 mmol/L NaCl 處理后，NtGT-2基因呈先上升后下降的趨勢，在處理1 h 的NtGT-2基因的表達量顯著上升，隨后呈不斷下降的趨勢，24 h 的表達量降至0 h 時的水平，下降了約40%（圖7 B）。在4℃低溫處理時，NtGT-2 基因的表達量和ABA 處理類似，呈先上升后下降再上升的趨勢，1 h 較0 h 的表達量顯著上升，處理12 h 表達量上升最多（達104%），處理24 h 后表達量顯著下降（圖7 C）。在15%的PEG6000 模擬干旱處理下，NtGT-2 基因的表達量整體呈下降趨勢，1、3、6、12及24 h 的表達量均低于0 h 水平（圖7 D）?？梢?，在不同的脅迫處理下，NtGT-2基因的表達模式不同。

圖6 NtGT-2 基因在煙草盛花期不同組織中的表達Fig.6 Expressions of NtGT-2 in different tissues during flowering stage of tobacco

圖7 NtGT-2 基因在不同脅迫處理下的表達模式分析Fig.7 Expression patterns of NtGT-2 gene under different stress treatments

3 討論

目前在煙草中已鑒定出多種Trihelix轉(zhuǎn)錄因子，比如GT-1家族的NtB2F基因參與光應(yīng)答反應(yīng)［13,27-28］，SIP1 家族的NtSIP1 基因參與細胞增殖［29］，而對煙草的Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子的GT-2 家族的研究較少。本研究中通過基因克隆法從煙草中克隆了一個Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為NtGT-2。SMART 在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示在NtGT-2 蛋白的C 端含有一個Trihelix 家族典型的Trihelix 保守結(jié)構(gòu)域（SANT結(jié)構(gòu)域），N 端未發(fā)現(xiàn)有保守結(jié)構(gòu)域［30］。這與之前研究發(fā)現(xiàn)擬南芥GT-2 亞家族成員At5g47660 的N端也無保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果一致［8］。此外，NtGT-2 蛋白含有一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（Coiled-coil 結(jié)構(gòu)域），該結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子的二聚化或多聚化有關(guān)［2］。

NtGT-2 基因在煙草的各個組織中均有表達，但NtGT-2 的基因表達具有組織差異性，其在莖節(jié)中的表達量最高。這與在大豆中的研究結(jié)果類似，大豆GmGT-2A基因在大豆的莖中的表達量最高，研究還發(fā)現(xiàn)GmGT-2B 在豆莢中的表達量最高［23］。說明GT-2 亞家族的成員在植物的生長發(fā)育過程中的表達模式有一定的相似性和差異性，推測與植物的生長發(fā)育過程中不同的Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子具有不同的調(diào)控功能有關(guān)。

對煙草進行ABA、高鹽、低溫及PEG 脅迫處理，發(fā)現(xiàn)NtGT-2 均有不同程度的響應(yīng)。根據(jù)NtGT-2 的表達趨勢推測其在ABA、低溫脅迫中具有正向調(diào)控的作用，在PEG 誘導(dǎo)的滲透脅迫和高鹽脅迫中具有負調(diào)控作用。例如，棉花GhGT-2 在ABA 脅迫下具有正向調(diào)控作用，GhGT29 在低溫和ABA 脅迫中都具有正向調(diào)控作用，GhGT30 在干旱脅迫處理下具有負向調(diào)控作用［31-33］。這與之前研究的Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子的GT-2 亞家族是植物在應(yīng)對高鹽脅迫、低溫脅迫和干旱脅迫的重要響應(yīng)因子,在植物抗逆性反應(yīng)中扮演著重要作用的結(jié)果一致［21］。煙草NtGT-2 基因在煙草逆境脅迫中的調(diào)控途徑還需進一步研究,以進一步明確NtGT-2基因功能，為改良煙草抗逆性提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過同源克隆法從普通煙草品種K326 中克隆到一個GT 基因，蛋白結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果顯示，NtGT-2 屬于GT-2 亞家族，命名為NtGT-2。熒光定量PCR 結(jié)果顯示NtGT-2在煙草不同組織中表達具有差異性，在莖稈莖節(jié)中表達量較高，在葉片和根中表達量較低。該基因?qū)χ参锛に谹BA 處理、高鹽、低溫及PEG 的脅迫處理具有不同程度的響應(yīng)，說明該基因參與煙草逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。