P16和P15在惡性黑色素瘤中的表達(dá)及其臨床意義

陳銓栩 陳灣灣 張 普 羅曉智 趙志光

惡性黑色瘤(malignant melanoma，MM)是起源于表皮黑素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、發(fā)展迅速、預(yù)后差及病死率高[1]。近年來世界范圍內(nèi)的黑色素瘤的發(fā)生率呈逐年增加的趨勢，發(fā)病年齡也逐漸年輕化，相應(yīng)的病死率也隨之增加[2,3]。MM發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，大多數(shù)MM存在BRAF基因突變，BRAF基因突變與MM發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[4]。另有研究顯示，大部分的痣長到3～5mm會(huì)進(jìn)入生長停滯，只有一小部分色素痣有重新獲得增殖并形成黑色素瘤的能力[5]。而原癌基因誘導(dǎo)的停滯與由CDKN2A和CDKN2B基因編碼的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P16和P15的表達(dá)相關(guān)。

本研究應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-perosidase, SP法)免疫組化檢測66例MM組織中P16、P15的表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)因素分析和預(yù)后分析，探討P16、P15在MM中的臨床意義。

材料與方法

1.標(biāo)本來源：收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2013年1月～2018 年1月經(jīng)病理科確診為惡性黑色素瘤的患者。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)患者病理診斷明確，相關(guān)MM免疫組化指標(biāo)支持，排除可疑性病理診斷及混合其他惡性成分的病理診斷。(2)患者腫瘤均行手術(shù)根治，術(shù)前未行抗腫瘤治療。(3)患者臨床資料完整，預(yù)后分析時(shí)排除隨訪時(shí)間不足1年失訪的患者。共納入66例MM的組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)60例同一時(shí)期診斷為皮內(nèi)痣的組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

2.研究方法：將所有標(biāo)本選取病變區(qū)域制成組織芯片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)進(jìn)行免疫組化。大致過程為：切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟水化，3%H2O2酶(北京中杉金橋公司)室溫孵育1h，檸檬酸修復(fù)液微波加熱修復(fù)10min并冷卻至室溫，非免疫血清(北京中杉金橋公司)室溫封閉3h，鼠抗人P16、P15抗體(英國Abcam公司)按1∶200稀釋后4℃冰箱孵育過夜，二抗(北京中杉金橋公司)室溫孵育1h，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(北京中杉金橋公司)室溫孵育1h，DAB試劑(北京中杉金橋公司)顯色，蘇木精中核復(fù)染，梯度乙醇及二甲苯中脫水，中性樹膠封片。統(tǒng)計(jì)患者的臨床及病理資料，包括性別、腫瘤部位、確診年齡、腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)和BRAF V600E基因突變情況等。主要通過電話以及住院觀察隨訪，截止時(shí)間至2019年6月，生存期以月為單位。

3.免疫組化結(jié)果判定：P16、P15陽性表現(xiàn)為黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞核，部分細(xì)胞質(zhì)也有少量表達(dá)。由兩位病理科醫(yī)生進(jìn)行雙盲閱片，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)進(jìn)行結(jié)果判定：(1)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率評(píng)分：0～10%為0分，10%(不含)～25%為1分，25%(不含)～50%為2分，>50%為3分。(2)著色深度評(píng)分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐黃色為3分。依據(jù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率×著色深度得出總分進(jìn)行判定：<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；預(yù)后分析采用Kaplan-Meier曲線，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.P16、P15在惡性黑色瘤與皮內(nèi)痣組織中的表達(dá)情況：P16在惡性黑色瘤和皮內(nèi)痣組織的陽性表達(dá)率分別為30.3%和81.7%；P15在MM和皮內(nèi)痣組織的陽性表達(dá)率分別為22.7%和86.7%。MM中的P16(χ2=33.470,P=0.000)和P15(χ2=51.603,P=0.000)陽性表達(dá)率均明顯低于皮內(nèi)痣，詳見圖1、表1。

圖1 P16、P15在MM與皮內(nèi)痣組織中的表達(dá)(SP法，×200)A、B.MM組織中P15、P16的表達(dá)；C、D.皮內(nèi)痣組織中P15、P16的表達(dá)。箭頭所指為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)染色。根據(jù)免疫組化結(jié)果判定：A(-)、B(-)、C(+)、D(-)

表1 P16、P15在MM與皮內(nèi)痣組織中的表達(dá)(n)

2.P16、P15在MM中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系：MM組織中P16的陽性表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度(χ2=17.888,P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.561,P=0.018)和Ki-67增殖指數(shù)(χ2=7.108,P=0.008)呈負(fù)相關(guān)，而與性別、腫瘤部位、確診年齡、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和BRAF V600E基因突變無關(guān)(P均>0.05)。P15的陽性表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度(χ2=9.156,P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.817,P=0.003)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=4.970,P=0.026)和Ki-67增殖指數(shù)(χ2=15.422,P=0.000)呈負(fù)相關(guān)，而與性別、腫瘤部位、確診年齡、腫瘤直徑和BRAF V600E基因突變無關(guān)(P均>0.05)，詳見表2。

3.MM中P16與P15表達(dá)水平的相關(guān)性：MM中P16與P15表達(dá)水平呈高度正相關(guān)(r=0.744)，詳見表3。

表2 P16、P15在MM中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系(n)

*BRAF基因檢測時(shí)有4例組織因標(biāo)本量太少無法檢測

表3 MM中P16與P15表達(dá)水平的相關(guān)性(n)

4.P16、P15在MM中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系：66例MM患者中，有3例患者在后期隨訪過程中失訪，最后共納入63例患者進(jìn)行預(yù)后分析；其中58例死亡，5例隨訪截止時(shí)仍存活?；颊呖傮w中位生存期為22.3個(gè)月，95% CI為13.523～31.077，1年、2年和3年生存率分別為82.5%、42.9%和21.9%。P16表達(dá)陰性的患者，中位總體生存期明顯短于表達(dá)陽性的患者(14.0個(gè)月 vs 28.6個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.033,P=0.025)。P15表達(dá)陰性的患者，中位總體生存期明顯短于表達(dá)陽性的患者(14.0個(gè)月 vs 33.4個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.949,P=0.003)，詳見圖2。

討 論

惡性黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤之一，大多數(shù)具有很強(qiáng)的侵襲性，較早發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。雖然我國發(fā)生率相對(duì)較低，但近年來發(fā)生率呈快速增長趨勢，已成為嚴(yán)重威脅生命健康的惡性疾病之一[6]。

圖2 P16、P15在MM中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系A(chǔ).MM患者總體生存期曲線；B.不同P16表達(dá)水平的MM患者總體生存期曲線；C.不同P15表達(dá)水平的MM患者總體生存期曲線

P16基因位于染色體9p21上，是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的腫瘤抑制基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)[7]。其表達(dá)產(chǎn)物P16INK4A可與CNK4和CNK6特異性結(jié)合，阻礙其與細(xì)胞蛋白D1形成復(fù)合物，使RB磷酸化受阻，使細(xì)胞停留在G1期，無法進(jìn)入S期，抑制腫瘤的增殖[8,9]。P15是CKI中INK4家族成員之一，它通過抑制CyclinD-CDK,將細(xì)胞阻斷在G1期[10]。當(dāng)P16、P15基因突變或失活時(shí)，P16、P15表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期無法調(diào)控，以致細(xì)胞無限生長從而發(fā)生腫瘤。臨床上，大多數(shù)痣長到3～5mm通常會(huì)退出增生期進(jìn)入生長停滯狀態(tài)。雖然大多數(shù)痣仍處于生長停滯狀態(tài)(甚至在高齡時(shí)段消退)，但有一小部分痣存在重新獲得增殖并形成黑色素瘤的能力[11]。癌基因誘導(dǎo)的停滯是由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN2A編碼的P16和CDKN2B編碼的P15高表達(dá)促進(jìn)的[12]。本研究結(jié)果顯示，P16和P15在MM中表達(dá)均下調(diào)，可能對(duì)鑒別MM和良性黑素細(xì)胞病變具有診斷價(jià)值。雖然MM中P16和P15的表達(dá)呈高度正相關(guān)，但相比較而言，P15的表達(dá)下調(diào)更顯著，可能成為診斷MM更可靠的生物學(xué)標(biāo)志物之一，這也與Ma等[13]的研究結(jié)果一致。

MM的分期與腫瘤的直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。P16、P15的表達(dá)水平與腫瘤的直徑并無明顯相關(guān)性，可能的原因是本研究應(yīng)用的組織芯片只包括部分腫瘤組織，對(duì)于較大的腫瘤有一定局限性。隨著病變浸潤深度的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，P16、P15的表達(dá)逐漸下降，表明兩者可能與MM的侵襲與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，可能的機(jī)制是P16、P15基因突變或失活時(shí)，細(xì)胞周期失去抑制，導(dǎo)致細(xì)胞無限生長以致腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移性增強(qiáng)。Su等[14]研究也顯示，在結(jié)膜惡性黑色素瘤中P16的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)，P15的表達(dá)與MM發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，表明在預(yù)測MM發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，P15更有優(yōu)勢。另外，表面有無破損也是腫瘤分期的指標(biāo)之一，然而大部分患者數(shù)據(jù)缺失，因此并無納入本研究。Ki-67 是一種細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，可以反映腫瘤的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等。本研究以10%為臨界點(diǎn)，得出P16、P15的表達(dá)與Ki-67增殖指數(shù)呈負(fù)相關(guān)；P16、P15表達(dá)缺失，腫瘤細(xì)胞增殖更活躍，可能通過多種機(jī)制增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力。BRAF基因突變是MM最常見的突變方式，主要是BRAF V600E突變，平均突變率為60%～80%，與MM發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。Mackiewicz-Wysocka等[7]研究顯示，色素痣P16的表達(dá)水平在BRAF突變型中更高，惡性黑色素瘤P16的表達(dá)水平在BRAF突變型中更低。而本研究顯示，P16的表達(dá)水平與BRAF基因無明顯相關(guān)性，可能的原因是痣細(xì)胞增殖被BRAFV600E瞬時(shí)激活，BRAFV600E也誘導(dǎo)P16表達(dá)來停止黑素細(xì)胞增殖[15]。

國內(nèi)外關(guān)于P16、P15與預(yù)后的關(guān)系，爭議很大。本研究顯示，P16與P15的表達(dá)水平均與MM的總體生存期呈正相關(guān)。P16與P15的表達(dá)水平下調(diào)，腫瘤細(xì)胞增殖更活躍，侵襲能力與轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，因而患者的預(yù)后不佳。吳曉雯等[16]研究也顯示，P16 INK4A 基因突變會(huì)阻礙與CNK4和CNK6特異性結(jié)合，從而腫瘤增殖更活躍，生存期更短。但是，Chen等[17]研究顯示，P16高表達(dá)預(yù)示黏膜黑色素瘤有較差的生存期；Sanki等[18]研究顯示，P16的表達(dá)與皮膚黑色素瘤的生存期無關(guān)。這種爭議，可能與納入的患者的分期以及治療不同有關(guān)，有待于增加樣本量進(jìn)一步研究。

本研究收集了筆者醫(yī)院近5年的MM患者66例，樣本量仍偏少；隨訪過程中，有3例(4.5%)患者失訪；隨訪截止時(shí)，有5例(7.9%)患者仍存活，這對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差。因此，筆者還會(huì)進(jìn)一步納入相關(guān)患者，延長隨訪時(shí)間，以得到更為可靠的結(jié)果[19]。

綜上所述，P16、P15可能在惡性黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展中起負(fù)性作用，可以作為鑒別MM和良性黑素細(xì)胞病變的指標(biāo)，也可能對(duì)MM患者的預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。