老年db/db小鼠生存狀態(tài)的評價研究

樊 蕊 郝云濤 徐美虹 李 勇

糖尿病是由多種因素引起的代謝性疾病，嚴(yán)重威脅人類的生命健康和生活質(zhì)量。2型糖尿病以胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能減退為特征，與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關(guān)，在臨床上主要表現(xiàn)為多飲、多尿、多食及體重減少。隨著社會發(fā)展和人們生活水平的提高，2型糖尿病的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，在發(fā)達(dá)國家糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)已經(jīng)躍居繼心腦血管疾病、癌癥之后的第3位[1]。

動物疾病模型的研究是人類疾病研究的基礎(chǔ)，目前2型糖尿病小鼠模型主要包括自發(fā)性糖尿病小鼠、誘導(dǎo)性糖尿病小鼠、轉(zhuǎn)基因及基因敲除小鼠。自發(fā)性糖尿病小鼠模型是指未經(jīng)任何有意識的人為處置，在自然條件下發(fā)生糖尿病的小鼠模型，其優(yōu)點為模型小鼠糖尿病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程與人類T2DM 相似，具有較高的應(yīng)用價值。其常見的模型有ob/ob小鼠、db/db小鼠、KK-Ay小鼠、新西蘭肥胖小鼠、NSY小鼠、TSOD小鼠、M16小鼠，且各模型均有其優(yōu)勢及局限性[2]。

db/db 小鼠是從 C57BL/6J 小鼠中篩選出的一株突變系，該小鼠由于常染色體隱性遺傳的瘦素受體基因缺陷，導(dǎo)致具有自發(fā)糖尿病特性，純合子(db/db)小鼠表現(xiàn)為肥胖及多飲、多食等癥狀。這種小鼠的發(fā)病過程與人類 2 型糖尿病表現(xiàn)極為相似，是研究人類 2 型糖尿病的理想動物模型[3]。

目前研究者對于db/db小鼠生命特征的研究多集中在20周齡以下，而對于老年db/db小鼠生命特征和生存質(zhì)量并未見報道，同時對于該模型小鼠的實際壽命的報道結(jié)果不一。在對糖尿病以及糖尿病老年患者的研究中，老年糖尿病患者的生存狀態(tài)是研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵問題和難點問題。本研究對db/db小鼠喂養(yǎng)終生，對其老年期間的生存狀態(tài)以及生存質(zhì)量予以探析，以期對充分恰當(dāng)?shù)膽?yīng)用該模型小鼠提供理論依據(jù)，同時對如何提高糖尿病患者老年的生存質(zhì)量提供思路和參考。

材料與方法

1.實驗動物：10周齡db/db 型糖尿病小鼠(20只)及與之周齡、性別匹配的非糖尿病的健康同窩出生仔畜(db/m小鼠，20只)，體質(zhì)量25±2g，飼養(yǎng)終生。由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號： SCXK(京) 2016-0010，屏障環(huán)境動物房[實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2016-0041]，SPF級動物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23℃，濕度50%～60%。以美國營養(yǎng)學(xué)會(AIN-93G)動物飼料作為基礎(chǔ)飼料，所有動物自由飲水進(jìn)食。待正常飼養(yǎng)至70周，進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

2.儀器：安穩(wěn)血糖儀、安穩(wěn)血糖試紙購自中國三諾公司; YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀購自濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司。

3.動物一般狀態(tài)觀察及體格指標(biāo)測定：每周觀測并記錄動物的活動度、毛發(fā)光澤、攝食量、飲水量、體質(zhì)量。

4.尿液收集：正常飼養(yǎng)71、75、79、83周的小鼠置于代謝籠中，收集24h尿液，尿液采集后，立即混勻，測定體積。

5.臟器指數(shù)：各組小鼠飼養(yǎng)臨近至壽命終點時，小鼠稱重后脫頸椎處死，無菌快速分離腎周脂肪、睪周脂肪，剝離腓腸肌，稱重；分別稱取小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺，計算臟器指數(shù)/脂肪系數(shù)。臟器/脂肪指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)×100%

6.隨機(jī)空腹血糖檢測：每隔4周監(jiān)測隨機(jī)空腹血糖，測定前禁食6h，測定時剪尾取血，采用血糖儀測定及記錄。

7.自主活動情況測定：分別將75周齡的db/db和db/m小鼠放入自主活動儀的活動箱內(nèi)，先適應(yīng)15min，再記錄小鼠5min內(nèi)活動次數(shù)和時間，然后取出小鼠。

結(jié) 果

1.老年db/db和db/m小鼠體質(zhì)量和攝食量的變化：(1)老年db/db隨著生長周齡的增加，其體質(zhì)量呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢，從70周齡的79.2g 降至83周齡的73.0g，降幅為7.8%。而db/m小鼠體質(zhì)量的變化大體恒定，僅從70周齡的44.2g 降低至瀕死狀態(tài)下的43.0g，但是在整個老年期，db/db小鼠整體體質(zhì)量顯著高于db/m小鼠(圖1)。(2)在老年期間，db/db小鼠攝食量未呈現(xiàn)規(guī)律變化，而db/m攝食量呈現(xiàn)曲折下降的趨勢，其整體攝入量始終低于db/db小鼠(圖2)。

圖1 老年db/db和db/m小鼠體質(zhì)量的變化

圖2 老年db/db和db/m小鼠攝食量的變化

2.老年db/db和db/m小鼠飲水量、尿量的變化：(1)從整體趨勢看，老年期間db/db小鼠和db/m小鼠飲水量無明顯變化，只是db/db 小鼠飲水量顯著高于db/m小鼠飲水量(圖3)。(2)兩組老鼠尿量的變化情況與飲水量相似，整個老年期間，變化量不明顯，但從整體而言，db/db小鼠尿量顯著高于db/m小鼠，其尿量為db/m小鼠尿量的4倍(圖4)。

圖3 老年db/db和db/m小鼠飲水量的變化

圖4 老年db/db和db/m小鼠尿量的變化

3.老年db/db和db/m小鼠自主活動情況：5min內(nèi)db/m和db/db小鼠的自主活動次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但db/m小鼠單次活動時長和累計活動時長均顯著長于db/db小鼠(P<0.05)，分別為db/db小鼠的6倍和5倍(表1)。

表1 老年db/db和db/m小鼠自主活動

與db/m比較，*P<0.05

4.db/db和db/m小鼠臟器指數(shù)：臨近壽命終點的db/db小鼠肝臟質(zhì)量和胰臟質(zhì)量>db/m小鼠，而db/db腎臟、脾臟以及睪丸質(zhì)量均db/m小鼠，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。db/db小鼠的腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胰臟指數(shù)和睪丸指數(shù)均

表2 臨近壽命終點db/db和db/m小鼠臟器質(zhì)量

與db/m比較，*P<0.05

表3 臨近壽命終點db/db和db/m小鼠臟器指數(shù)

與db/m比較，*P<0.05

5.db/db和db/m小鼠脂肪和腓腸肌系數(shù)：從小鼠的解剖情況下看，臨近壽命終點的db/db小鼠其體型明顯>db/m小鼠，而且其皮下脂肪顯著多于db/m小鼠，db/m小鼠的腎周脂肪和睪周脂肪的比重均顯著>db/m小鼠(P<0.05)，而其腓腸肌比重顯著低于db/m小鼠(P<0.05,圖5)。

圖5 db/db和db/m小鼠臨近壽命終點脂肪和腓腸肌指數(shù)與db/m比較，*P<0.05

6.老年db/db和db/m小鼠血糖變化情況：老年期間db/db小鼠的血糖隨著生長周齡的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，而db/m小鼠血糖則呈現(xiàn)微小增加趨勢，整體來看，db/db小鼠血糖高于db/m小鼠，其中71周齡和75周齡db/db小鼠血糖顯著高于db/m小鼠(P<0.05，圖6)。

圖6 老年db/db和db/m小鼠的血糖變化情況與db/m比較，*P<0.05

7.db/db和db/m小鼠存活率：隨著小鼠生命的延續(xù)，其存活率呈現(xiàn)下降趨勢。<81周齡，db/db和db/m小鼠的存活率恒定，分別為100%和73%，但高于81周齡后，db/m小鼠開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而db/db小鼠則出現(xiàn)了大量死亡的現(xiàn)象，截止83周，其生存率僅為20%，84周其生存率下降至0(圖7)。

圖7 db/db和db/m小鼠存活率

討 論

db/db小鼠主要表現(xiàn)為下丘腦缺陷，它不能產(chǎn)生飽感，即對飽感物質(zhì)(瘦素)缺乏反應(yīng)，從而合成代謝大于分解代謝，引起脂肪的堆積而肥胖，逐漸發(fā)展為嚴(yán)重的糖尿病伴有明顯的高糖血癥。該小鼠具有和人類2型糖尿病相似的臨床癥狀，多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗、脂代謝異常等綜合征[3～5]。圖1顯示db/db小鼠體質(zhì)量顯著高于對照db/m小鼠，而圖5也顯示，db/db小鼠其皮下脂肪遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于db/m小鼠，且腎周脂肪和睪周脂肪含量也顯著高于db/m小鼠。圖1～圖4顯示，db/db 小鼠的攝食量、飲水量以及尿量顯著高于db/m小鼠，可見即使老年db/db小鼠仍然具有典型的多飲、多食、多尿、肥胖等癥狀。

相比于以往對集中在20周齡以下的db/db小鼠的研究，本研究更多地反映老年期db/db小鼠的生存質(zhì)量和生命特征，并且根據(jù)以往報道的db/db小鼠10個月的生存壽命，研究在正常飼養(yǎng)條件下，70周齡以后的db/db小鼠的生存狀態(tài)。

動物衰老時，由于構(gòu)成機(jī)體的主要物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸、脂肪的代謝率下降，合成量少于分解量，結(jié)構(gòu)物質(zhì)不斷損耗，細(xì)胞間及細(xì)胞質(zhì)中的水分失去依托也逐漸喪失，導(dǎo)致其體質(zhì)量不斷下降。圖1顯示老年db/db隨著生長周齡的增加，其體質(zhì)量呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢， 而db/m小鼠體質(zhì)量的變化大體恒定。當(dāng)步入老年，體力出現(xiàn)明顯下降，這是由于骨骼肌中蛋白質(zhì)合成量不足，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞后氧化磷酸化功能受損，ATP合成減少所致[6]。同時，神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的功能和表現(xiàn)也出現(xiàn)衰退，其表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量的下降和肌力減退。有文獻(xiàn)報道，糖尿病模型鼠，自主活動明顯減少，行動遲緩，伴有顫抖現(xiàn)象[7]。本實驗對db/db小鼠的自主活動進(jìn)行了評價，db/m小鼠單次活動時長和累計活動時長均顯著長于db/db小鼠(P<0.05)，分別為db/db小鼠的6倍和5倍。兩者的腓腸肌含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

衰老的因素很多，部分研究者認(rèn)為免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)老化與功能下降是衰老的主要原因與標(biāo)志。實驗動物臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)是鑒定動物遺傳品質(zhì)的重要依據(jù), 動物內(nèi)臟器官的質(zhì)量、臟器系數(shù)是許多生物醫(yī)學(xué)研究中常用的重要數(shù)據(jù)[8]。本研究通過對臨近壽命終點的db/db和db/m小鼠的臟器進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，臨近壽命終點的db/db小鼠的肝臟指數(shù)>db/m小鼠，而db/db小鼠的腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胰臟指數(shù)和睪丸指數(shù)均

研究表明，脾臟作為外周免疫器官，隨著年齡增加而逐漸減小，性質(zhì)發(fā)生改變。其代謝也隨之減弱，這可能導(dǎo)致免疫功能降低。因此，脾臟的萎縮，代表機(jī)體免疫功能減弱，可加速衰老進(jìn)程[11]。Homo-Delarche等[12]研究報道糖尿病動物模型會出現(xiàn)胰島增生肥大的病理改變，7月齡db/db純合仔小鼠胰腺體積較大，胰島中均見淋巴細(xì)胞浸潤；12月齡db/db小鼠胰腺部分胰島內(nèi)及其周圍組織有灶性淋巴細(xì)胞浸潤，部分胰島內(nèi)見較多小導(dǎo)管樣病變，胰腺小導(dǎo)管病變有增生擴(kuò)張及潴留，使得胰島細(xì)胞之間間隙增寬[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)db/db胰腺質(zhì)量>db/m小鼠。另外，本研究中db/db小鼠睪丸的質(zhì)量

據(jù)文獻(xiàn)報道，db/db小鼠從4周齡即出現(xiàn)貪食，產(chǎn)生可以辨認(rèn)的肥胖表型。出生后10～14天，血漿胰島素和血糖開始升高，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀，其發(fā)病過程與2型糖尿病患者非常相似[14]。純合子db/db小鼠在早期發(fā)育階段，甚至于在3～4周齡時即顯現(xiàn)糖尿病征兆。>8周齡的db/db小鼠，其血糖值已經(jīng)持續(xù)在20mmol/L以上，db/db小鼠的血糖值隨年齡增大而逐步升高，當(dāng)3～6月齡，血糖最高可達(dá)到35mmol/L以上，隨后小鼠的體質(zhì)量開始逐漸減輕，7月齡的db/db小鼠其血清血糖水平為15mmol/L[15]。本研究中老年db/db小鼠的血糖水平顯著高于db/m小鼠，但是隨著生長周齡的增加，db/db小鼠的血糖水平呈現(xiàn)微小降低的趨勢，從70周齡空腹血糖11.0mmol/L下降至79周齡的8.5mmol/L[16]。目前雖然未有報道老齡db/db血糖變化情況，但其變化趨勢與文獻(xiàn)預(yù)測相似。>6月齡的db/db小鼠隨著月齡增加，其血糖隨之降低，最后直至發(fā)病致死[15]。

關(guān)于db/db小鼠壽命的報道顯示，純合子糖尿病小鼠db/db于3～8周齡時開始貪食及發(fā)胖，體質(zhì)量增重加速，繼而產(chǎn)生高血糖、高血胰島素，胰高血糖素也升高，屬于肥胖型高血糖糖尿病模型。一般在10個月內(nèi)死亡，其平均壽命約6～8個月，但也有個別報道，其可以活到12月齡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，<81周齡，db/db和db/m小鼠的存活率恒定，分別為100%和73%，但高于81周齡后，db/m小鼠開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而db/db小鼠則出現(xiàn)了大量死亡的現(xiàn)象，截止84周其生存率急劇下降至0。

目前報道中尚未發(fā)現(xiàn)db/db小鼠存活時間>60周齡，本研究發(fā)現(xiàn)，即使不經(jīng)過任何干預(yù)，自然生長的db/db小鼠70月齡的生存率為72%，db/db小鼠壽命遠(yuǎn)大于相關(guān)文獻(xiàn)的報道，分析其原因，(1)與目前存在的早期報道的db/db小鼠壽命比較，早期實驗飼養(yǎng)環(huán)境可能會影響其壽命。(2)近年來未有文獻(xiàn)專門研究db/db小鼠的生存年限，僅有極少數(shù)文獻(xiàn)有報道，在嚴(yán)格的飼養(yǎng)條件下，飲用水為消毒酸化水，飼養(yǎng)用具嚴(yán)格滅菌，飼養(yǎng)溫度20～26℃，濕度為50%～70%，db/db小鼠可以安全存活至12月齡。12月齡的小鼠僅表現(xiàn)為一些組織病理學(xué)的改變，如部分胰島內(nèi)及其周圍組織有灶性淋巴細(xì)胞浸潤，可見小導(dǎo)管樣病變，胰腺小導(dǎo)管病變有增生擴(kuò)張及潴留。腎臟中腎小球細(xì)胞數(shù)目、系膜基質(zhì)增多，系膜細(xì)胞增生[13]。

綜上所述，老年db/db小鼠的生命體征和生存質(zhì)量需要深入研究，并且db/db小鼠壽命的延長機(jī)制值得進(jìn)一步探討，將在后續(xù)實驗中開展進(jìn)一步延長壽命的營養(yǎng)干預(yù)措施研究。