MiR-130b在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對血管生長的影響

張 靜 周永剛 舒俊斌 李曉波 呂曉俊 葉汝勇 李正在

新生血管的生成在實體瘤的發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，實體瘤生長至2mm3左右就必須要新生血管長入才能繼續(xù)維持腫瘤血供，血管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)增殖并相互連接形成新生血管，為腫瘤細(xì)胞惡性增殖所必須的氧氣及營養(yǎng)成分提供血運通路，同時為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了準(zhǔn)備條件。膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有極強(qiáng)的侵襲性，當(dāng)前膠質(zhì)瘤患者的治療存在高復(fù)發(fā)率和高病死率這兩大難題，預(yù)后較差，同時膠質(zhì)瘤作為一種血供較為豐富的腫瘤，其血管新生異常旺盛[1, 2]。因此，探討膠質(zhì)瘤血管新生的分子作用機(jī)制和潛在的遺傳異常是當(dāng)前亟待解決的問題。

既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為基因組中的非編碼序列，可通過與靶基因的3′-UTR的配對從而降解或抑制靶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而在機(jī)體發(fā)育、分化和代謝等多個生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[3,4]。當(dāng)前研究表明，miR-130b在肺癌和甲狀腺癌等多種實體腫瘤中表達(dá)下調(diào)[5,6]。同時miR-130b與胰腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中特異性上調(diào)miR-130b的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞血管生長[8]。以上研究表明miR-130b與惡性腫瘤多種惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，而miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)和惡性生物學(xué)行為的關(guān)系尚未有研究報道。因此，本研究將探討miR-130b在膠質(zhì)瘤血管新生中的作用及具體作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的防治研究提供有益參考。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑:膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、SHG-44和U87及人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA購自上海細(xì)胞生物研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自杭州四季青公司；EGM-2培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；含EDTA胰蛋白酶購自中國吉諾公司；LipofectamineTM2000購自美國Life Technologies公司；miR-130b及內(nèi)參U6引物和探針由廣州銳博生物公司設(shè)計合成；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自美國ABI 公司；miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑及其陰性對照模擬物NC和抑制劑NC均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；VEGFA酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA裂解液購自北京中山生物工程公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；EMSA試劑盒購自美國Pierce公司；TNF-α和VEGFA抗體購自美國Epitomics公司；β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：U251、SHG-44、U87和NHA細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，HUVECs培養(yǎng)于EGM-2培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基中均添加10%的胎牛血清，細(xì)胞均置于37℃、5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞貼壁鋪滿80%～90%視野時，使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化傳代。

3.細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：收集對數(shù)生長期膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為5×106/ml，將細(xì)胞懸液接種至6孔板中，每孔100μl，每組設(shè)3個復(fù)孔，待細(xì)胞融合至70%～80%時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進(jìn)行操作，實驗分為以下4組：①模擬物NC組：每孔U87細(xì)胞加入100nmol的模擬物NC及5μl 轉(zhuǎn)染試劑；②miR-130b模擬物組：每孔U87細(xì)胞加入100nmol的miR-130b模擬物及5μl轉(zhuǎn)染試劑；③抑制劑NC組：每孔U251細(xì)胞加入100nmol的抑制劑NC及5μl 轉(zhuǎn)染試劑；④miR-130b抑制劑組：每孔U251細(xì)胞加入100nmol的miR-130b抑制劑及5μl 轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞行PCR檢測，確定轉(zhuǎn)染效率后再進(jìn)行細(xì)胞體外實驗。

4.qRT-PCR檢測miR-130b 的表達(dá)：在轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，RNA濃度由超微量分光光度計檢測，反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，設(shè)置U6作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計算miR-130b的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次，取平均值。

5.收集膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)：將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至80%底面積時用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，再加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基20ml，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12h后收集上清液，以2500r/min速度下常溫離心5min，將上清液用0.22μm過濾器過濾后，保存于4℃冰箱中。

6.ELISA法檢測CM中VEGFA含量:取出冷藏的CM，按照VEGFA酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品濃度，在ELX808U酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)上自動擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測各孔吸光度(A)值，計算出樣本CM中VEGFA的含量。

7.Transwell小室侵襲實驗:將Matrigel基底膠使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋7倍，將稀釋好的基底膠均勻鋪被到Transwell上室底部，然后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h以促進(jìn)Matrigel凝固。待Matrigel膠完全凝固后，小心取出上室并吸去殘余液體，再加入50μl無血清DMEM培養(yǎng)基，然后再放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5h。將20μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室中，同時在Transwell下室中添加500μl含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，然后將Transwell小室放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h，實驗重復(fù)3次，每組設(shè)5個復(fù)孔。將放置培養(yǎng)箱中孵育24h的Transwell小室取出，去除上室及下室中的培養(yǎng)基，用棉棒小心擦去小室底膜上的細(xì)胞，并用無菌PBS液小心清洗2遍。將Transwell上室放置在10%甲醇溶液中固定20min，用PBS液清洗3遍后再用結(jié)晶紫溶液染色15min。將Transwell上室自結(jié)晶紫溶液中取出后，使用PBS溶液清洗3遍，將Transwell上室置于載物片上，放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，在高倍鏡下隨機(jī)選擇10個視野拍照并采集圖像。

8.小管形成實驗:將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)瓶中，加入含20% FBS的EGM-2培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至80%底面積時用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗2次，加入CM培養(yǎng)24h。實驗組設(shè)置為不同組別CM培養(yǎng)的HUVECs，對照組設(shè)置為含1% FBS的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs。將不含胎牛血清的培養(yǎng)基和Matrigel膠放置4℃冰箱過夜預(yù)冷，待其變成膠凍狀，以1∶2的比例混合培養(yǎng)基和Matrigel膠，將250μl稀釋后的Matrigel膠加入24孔板中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h，至Matrigel膠凝固。調(diào)整HUVECs濃度為2×105/L，將0.1ml細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24孔板中，再放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，最后在倒置顯微鏡下觀察小管形成狀況。

9.熒光素酶報告基因檢測:將重組熒光素酶報告載體mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR或wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR共轉(zhuǎn)染入U87細(xì)胞中，再分別將miRNA-130b抑制劑或抑制劑NC轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后收獲細(xì)胞，按熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書提供的方法對樣品熒光素酶活性進(jìn)行檢測，每組樣本設(shè)5個復(fù)孔，熒光素酶相對活性=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

10.EMSA檢測NF-κB活性:按照EMSA試劑盒的說明書進(jìn)行檢測，使用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞后，再使用BSA法對各組細(xì)胞蛋白含量進(jìn)行測定。雙鏈寡核酸NF-κB序列探針(正義鏈：5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′,反義鏈：5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACCTGA-3′)，6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠100V預(yù)電泳60min，待溴酚藍(lán)泳動為3/4全長時停止電泳，再將帶正電的尼龍膜和膠同時夾入電泳轉(zhuǎn)移槽進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移，反應(yīng)條件為380mA轉(zhuǎn)移30min。將膜置于濾紙上吸干水分后轉(zhuǎn)移至紫外燈下交聯(lián)15min，在封閉液和平衡液中于室溫下分別反應(yīng)20min，經(jīng)化學(xué)發(fā)光和X線曝光后拍照，用Quantity One 4.6.2(BIO, RAD)軟件對圖形進(jìn)行光密度掃描，灰度值越高表示NF-κB激活程度越高。

11.Western blot法檢測蛋白表達(dá)：膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取蛋白后經(jīng)按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書提取總蛋白，每份樣品使用20μg蛋白質(zhì)，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在4℃下使用5%脫脂奶粉封閉過夜，硝酸纖維素膜經(jīng)一抗和二抗反應(yīng)后滴加新鮮配置的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光和顯影。

結(jié) 果

1.miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá):應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測膠質(zhì)瘤U251、SHG-44和U87細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA中miR-130b的表達(dá)，NHA細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)水平分別為U251、SHG-44和U87細(xì)胞的4.29、7.23和10.30倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。在3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，U251細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)相對較高，而miR-130b在U87細(xì)胞中的表達(dá)相對較低，選擇U251和U87細(xì)胞作為后續(xù)實驗材料(圖1)。

圖1 miR-130b在不同細(xì)胞株中的表達(dá)與NHA比較，*P=0.000

2.轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-130b和VEGFA表達(dá)的影響:將miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，同時將miR-130b 抑制劑轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞48h后，利用實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)明顯高于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)水平顯著低于抑制劑 NC組(P=0.000)。miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h后，收集膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基，應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)水平，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)明顯低于模擬物NC組(P=0.004)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000,圖2)。

3.過表達(dá)/干擾miR-130b后膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM對體外HUVECs侵襲和小管形成的影響：為評估干擾/過表達(dá)miR-130b后膠質(zhì)瘤細(xì)胞對體外HUVECs運動能力的影響，筆者分別提取了轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑及其對照的細(xì)胞CM，HUVECs經(jīng)CM作用24h后進(jìn)行Transwell小室侵襲實驗。如圖3A所示，細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果表明，HUVECs經(jīng)miR-130b模擬物組細(xì)胞的CM處理后，侵襲出Matrigel的細(xì)胞數(shù)為14.8±2.8，顯著低于模擬物 NC組(34.5±5.9)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；而HUVECs經(jīng)miR-130b抑制劑組細(xì)胞的CM處理后，侵襲出Matrigel的細(xì)胞數(shù)為52.8±6.5，明顯高于抑制劑NC組(30.1±4.3)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。

圖2 miR-130b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGFA表達(dá)的影響A.miR-130b;B.VEGFA

利用小管形成實驗檢驗過表達(dá)/干擾miR-130b的膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM對體外HUVECs的血管生成能力，HUVECs在體外Matrigel基質(zhì)環(huán)境中生長12h后，細(xì)胞逐漸向兩端延長呈梭形，同時細(xì)胞延長端開始在Matrigel膠中伸展，相鄰細(xì)胞開始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。miR-130b模擬物組細(xì)胞CM處理的HUVECs體外小管形成數(shù)為24.9±2.7，顯著低于模擬物NC組(36.7±4.5)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)；miR-130b抑制劑組細(xì)胞CM處理的HUVECs體外小管形成數(shù)為57.8±8.3，明顯高于抑制劑NC組(31.4±4.5)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002,圖3)。

圖3 miR-130b對HUVECs遷移和小管形成能力的影響A.Transwell小室侵襲實驗；B.小管形成實驗

4.TNF-α是miR-130b的直接靶基因：為了研究miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管新生中的可能作用機(jī)制，通過檢索miRBase數(shù)據(jù)庫獲得has-miR-130b序列，并通過運用生物信息學(xué)工具RNAhybrid 2.1、TargetScan和PicTar對miR-130b靶基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TNF-α與has-miR-130b存在潛在的結(jié)合位點(圖4A)。為此，筆者進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶報告檢測系統(tǒng)對體外U87細(xì)胞中miR-130b對TNF-α的調(diào)控作用進(jìn)行驗證。

熒光素酶報告檢測系統(tǒng)結(jié)果(圖4B)顯示，與共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和抑制劑NC后細(xì)胞熒光素酶活性比較，在U87細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和miR-130b抑制劑后的熒光素酶活性值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)；而共轉(zhuǎn)染mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和miRNA-130b抑制劑后細(xì)胞熒光素酶活性值與共轉(zhuǎn)染mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和抑制劑NC后的細(xì)胞熒光素酶活性值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miRNA-130b模擬物和miRNA-130b抑制劑分別轉(zhuǎn)染U87和U251后，應(yīng)用Western blot法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α蛋白的表達(dá)，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)明顯低于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b 抑制劑組U251細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000，圖4C)。以上結(jié)果表明，miRNA-130b可與TNF-α的3′-UTR結(jié)合，TNF-α是miR-130b的直接靶向基因。

圖4 miR-130b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α和VEGFA表達(dá)的影響A.生物信息學(xué)工具預(yù)測靶基因；B.熒光素酶報告檢測系統(tǒng)；C.蛋白質(zhì)電泳圖

5.過表達(dá)/干擾miR-130b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性及VEGFA蛋白表達(dá)的影響：將miR-130b模擬物或模擬物NC轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，同時將miR-130b抑制劑或抑制劑NC轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞48h后，利用EMSA檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性，結(jié)果如圖5所示，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中NF-κB活性較模擬物NC組明顯減弱(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞中NF-κB活性顯著強(qiáng)于抑制劑NC組(P=0.000)。

miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h 后，應(yīng)用Western blot法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGFA蛋白的表達(dá)水平， miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)明顯低于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000)。

圖5 miR-130b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性的影響

討 論

目前國內(nèi)外公認(rèn)的高級別膠質(zhì)瘤有效的治療方案是根治性手術(shù)治療配合術(shù)后放療、化療，但即便接受正規(guī)的內(nèi)外科聯(lián)合治療，其中位生存期也不超過12個月，因此，膠質(zhì)瘤的防治研究是目前神經(jīng)外科學(xué)家和基礎(chǔ)科研工作者所面臨的重任。研究表明，miRNAs在多種惡性腫瘤中扮演著致癌基因或抑癌基因的角色，同時在腫瘤轉(zhuǎn)移和血管新生中發(fā)揮著重要作用。miR-130b在多種惡性腫瘤中表達(dá)減少，同時與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)，但miR-130b與膠質(zhì)瘤相關(guān)性研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，因此，需要進(jìn)一步研究miR-130b在膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為中的作用。

血管新生作為一種新生血管管腔形成的生理過程，這個過程受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子雙重調(diào)控。既往研究表明，作為血管生成促進(jìn)因子中最重要的一種，VEGFA在促進(jìn)多種惡性腫瘤血管生成過程中起著至關(guān)重要的作用[9, 10]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGFA與腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。此外，VEGF拮抗劑如貝伐珠單抗應(yīng)用于臨床可改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[12]。本研究表明，上調(diào)miR-130b的表達(dá)可抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)，而下調(diào)miR-130b的表達(dá)可促進(jìn)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)。因此，筆者提出miR-130b可能對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的血管新生產(chǎn)生一定抑制作用，本研究印證了這一假設(shè)。本研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-130b的表達(dá)對HUVECs的運動能力和血管生成具有抑制作用，而下調(diào)miR-130b的表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞促進(jìn)血管生成的啟動和維持過程中起到重要作用，從而表明miR-130b對膠質(zhì)瘤血管新生是必不可少的。然而，關(guān)于miR-130b如何調(diào)控血管生成以及miR-130b和VEGFA在膠質(zhì)瘤中的中間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。

TNF-α在大量良性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵調(diào)節(jié)器的作用[13]。最新證據(jù)顯示，TNF-α參與調(diào)節(jié)正常和異常的血管生成；人體血管內(nèi)皮細(xì)胞在TNF-α的作用下可促進(jìn)血管細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞內(nèi)黏附分子和VEGFA的分泌[14]。腫瘤細(xì)胞活化的肌成纖維細(xì)胞所分泌的TNF-α可以通過誘導(dǎo)促血管生成因子的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞外滲和血管生成[15]。然而，迄今為止尚未有miR-130-b和TNF-α的生物學(xué)功能研究報道。在筆者的研究中，下調(diào)miR-130b的表達(dá)可促進(jìn)TNF-α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，而TNF-α在miR-130b高表達(dá)的U251細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低。此外，熒光素酶報告實驗進(jìn)一步證實，miR-130b直接靶向調(diào)控TNF-α。

研究表明，NF-κB在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并且黏附分子和VEGF的表達(dá)與激活的NF-κB直接相關(guān)[16, 17]。TNF-α作為NF-κB的主要活化因子之一，TNF-α激活NF-κB的作用機(jī)制已有詳盡的研究[18，19]。本研究表明，miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的異位表達(dá)可抑制NF-κB活性，而敲除miR-130b的表達(dá)可增強(qiáng)NF-κB活性。此外，筆者發(fā)現(xiàn)miR-130b的表達(dá)下調(diào)可增加NF-κB的下游基因，如VEGFA的表達(dá)。至此，筆者發(fā)現(xiàn)miR-130b與VEGFA之間的調(diào)控機(jī)制是通過TNF-α/NF-κB這一中間信號通道來實現(xiàn)，TNF-α/NF-κB信號通道可誘導(dǎo)下游促血管生成因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管新生，miR-130b/TNF-α/NF-κB/VEGFA信號通路可能在調(diào)控膠質(zhì)瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究強(qiáng)調(diào)了miR-130b和VEGFA之間的相互作用的重要性，miR-130b可直接靶向調(diào)控 TNF-α，從而進(jìn)一步調(diào)控NF-κB信號通道而控制膠質(zhì)瘤血管生成。從機(jī)制上看，下調(diào)miR-130b可促進(jìn)TNF-α的高水平表達(dá)，并有助于NF-κB激活和其下游基因VEGFA的表達(dá)。這樣，miR-130b/TNF-α/NF-κB/VEGFA通路可能是未來膠質(zhì)瘤治療的具體作用靶點，從而在揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及治療上具有一定積極意義。