lncRNA MRAK048635_P1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞miRNA的調(diào)控作用

方根強(qiáng) 祁 佳 黃黎亞 趙仙先 陳書艷

高血壓是心腦血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素。血壓持續(xù)升高導(dǎo)致的血管重塑和血管功能障礙是造成心腦血管疾病患者死亡的重要原因。血管重塑是由于血管平滑肌細(xì)胞 (vascular smooth muscle cell，VSMC)的異常增殖、遷移和侵襲所引起的[1，2]。長(zhǎng)度>200nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是一類重要的非編碼轉(zhuǎn)錄本[3]。lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，并廣泛參與眾多生物學(xué)過程[4]。最近的研究顯示，lncRNA在心血管疾病中也起著至關(guān)重要的作用。Kumarswamy等[5]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA uc022bqs.1在心力衰竭患者中的表達(dá)水平明顯增加，并且與心血管死亡的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1與糖尿病引起的微血管功能障礙密切相關(guān)[6]。Chen等[7]報(bào)道lncRNA NR_104181高表達(dá)和NR_027032低表達(dá)可能與高血壓風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

lncRNA可作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA (competitive endogenous RNA，ceRNA)與microRNAs (miRNAs)相互作用，參與調(diào)控靶基因的表達(dá)。在這一過程中，lncRNA通過應(yīng)答元件 (miRNAs response element，MRE)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合具有相同MRE的miRNAs從而參與靶基因的表達(dá)調(diào)控[8，9]。另外,再狹窄 (restenosis)主要是由于血管中VSMC過度增殖所致。Lv等[10]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19來(lái)源的miR-675通過靶向原癌基因PTEN加重血管再狹窄。另外，Tian等[11]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1能夠通過抑制miR-26a調(diào)控VSMC的增殖和遷移能力?？傊?，越來(lái)越多的證據(jù)顯示lncRNAs和miRNAs與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)lncRNA的靶miRNAs并對(duì)其靶基因進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)分析是研究其作用機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，而生物信息學(xué)工具可以快速有效地提供靶基因預(yù)測(cè)、基因測(cè)序和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等方面數(shù)據(jù)。

為了探究lncRNA在高血壓病VSMC中的生物學(xué)作用，Yao等[12]利用基因芯片篩選自發(fā)性高血壓大鼠 (spontaneously hypertensive rats，SHR)和Wistar-Kyoto大鼠 (WKY)的主動(dòng)脈中VSMC的lncRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示68個(gè)lncRNAs被上調(diào)，而167個(gè)lncRNAs在SHR的主動(dòng)脈中被下調(diào)。研究表明，lncRNA MRAK048635_P1可在Wistar-Kyoto大鼠中出現(xiàn)明顯的表達(dá)量變化[13]。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，lncRNA MRAK048635_P1水平的降低可能是高血壓血管重構(gòu)的重要因素，調(diào)節(jié)vsmc功能和表型，降低MRAK048635_P1可能是治療原發(fā)性高血壓的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[14]。在筆者前期研究中為了進(jìn)一步探討MRAK048635_P1潛在的機(jī)制功能，嘗試預(yù)測(cè)可能與MRAK048635_P1相互作用的miRNAs,但未獲得相關(guān)結(jié)果。同時(shí)，筆者也注意到SHR中MRAK048635_P1的表達(dá)水平與WKY比較存在顯著差異，說明MRAK048635_P1在大鼠自發(fā)性高血壓中參與對(duì)VSMC的調(diào)節(jié)。本研究以MRAK048635_P1為切入點(diǎn)，系統(tǒng)分析了其參與調(diào)控的miRNAs及相應(yīng)靶基因，用以探討MRAK048635_P1與高血壓發(fā)病機(jī)制間的相關(guān)性。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和VSMC的制備: 實(shí)驗(yàn)用大鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。VSMC分離自正常大鼠主動(dòng)脈，具體方法參考文獻(xiàn)[15]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)原則。siMRAK048635_P1和對(duì)照組siRNA質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，并使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (13-778-075，美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染。miR-122-5p inhibitor以及miR-122-5p inhibitor negative control (NC)質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

2.差異miRNAs聚類分析： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白組、NC組、siRNA1組、siRNA2組 、siRNA3組進(jìn)行差異miRNAs聚類分析。差異miRNAs聚類分析用于判斷不同實(shí)驗(yàn)條件下差異miRNAs表達(dá)量的聚類模式。根據(jù)miRNAs的表達(dá)量進(jìn)行的聚類，通過log10 (TPM+1)進(jìn)行計(jì)算，是為了判斷不同實(shí)驗(yàn)條件下差異miRNAs表達(dá)量的聚類模式。聚類使用的為R軟件中的聚類軟件包pheatmap，所針對(duì)的數(shù)據(jù)為union_for_cluster (差異miRNAs的并集)，以miRNAs的相對(duì)表達(dá)水平值log2 (ratios) 進(jìn)行聚類。其采用相應(yīng)的距離算法，算出每個(gè)miRNAs之間的距離,然后通過反復(fù)迭代，計(jì)算miRNAs之間的相對(duì)距離,最后根據(jù)miRNAs的相對(duì)距離遠(yuǎn)近分成不同的subcluster，從而實(shí)現(xiàn)聚類。

3.GO富集分析: GO分析方法為GOseq，此方法基于Wallenius non-central hyper-geometric distribution，相對(duì)于普通的Hyper-geometric distribution，此分布的特點(diǎn)是從某個(gè)類別中抽取個(gè)體的概率與從某個(gè)類別之外抽取一個(gè)個(gè)體的概率是不同的，這種概率的不同是通過對(duì)基因長(zhǎng)度的偏好性進(jìn)行估計(jì)得到的，從而能更為準(zhǔn)確地計(jì)算出GO term被候選靶基因富集的概率[16]。本研究中筆者針對(duì)細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程進(jìn)行富集分析。

4.KEGG通路富集分析: 通路顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景比較，在候選靶基因中顯著性富集的Pathway。用BH的方法對(duì)P值進(jìn)行校正，得到的校正后的P值越小代表越顯著。這里將P<0.05的通路定義為在候選靶基因中顯著富集的通路。

5.qRT-PCR:VSMC分別轉(zhuǎn)染Scr siRNA和siMRAK048635_P1， 檢測(cè)Scr siRNA組和siMRAK048635_P1組VSMC中MRAK048635_P1、miR-122-5p和Gper1的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)miR-122-5p inhibitor組和miR-122-5p inhibitor negative(NC)組VSMC中miR-122-5p和Gper1的表達(dá)。使用Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)提取大鼠VSMC中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(瑞士Biotool公司，B24403)，然后進(jìn)行qRT-PCR(瑞士Biotool公司，B21202)。Gper1上游引物為：5′-GGACAACTTACTGATGCTAGGG-3′；下游引物為：5′-CGGTGCAGCTGGAACAACCGAC-3′。采用20μl PCR反應(yīng)體系: ddH2O 7μl，上下游引物各0.5μl，PCR Super Master Mix 10μl，cDNA 2μl。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min預(yù)變性，95℃ 30s變性，55℃ 30s退火、72℃ 30s延伸，共40個(gè)循環(huán)。采用△△Ct法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.差異miRNAs聚類分析:在VSMC細(xì)胞中，特異性siRNA被用來(lái)下調(diào)大鼠VSMC中MRAK048635_P1的表達(dá)水平 (圖1A)。然后，通過對(duì)敲降效果最好的siRNA2干擾前后的VSMC中miRNA進(jìn)行二代測(cè)序，隨后，筆者利用散點(diǎn)圖對(duì)miRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)大量的miRNAs在NC組和siRNA組之間有差異表達(dá) (圖1B)。層次聚類分析用于判斷各組中差異表達(dá)的miRNAs，其結(jié)果顯示siRNA介導(dǎo)MRAK048635_P1下調(diào)后，共有12個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs分別是miR-122-5p (2.3倍)、miR-122b (2.5倍)、miR-127-3p (3.6倍)、miR-206-3p (3.6倍)、miR-434-5p (7.5倍)，下調(diào)的miRNAs分別是miR-1b (2.6倍)、miR-451-5p (3.6倍)、miR-143-3p (1.5倍)、miR-99a-5p (1.9倍)、miR-133a-3p (2.8倍)、miR-133c (2.8倍)和miR-146a-5p (1.0倍) (圖1C)。

圖1 差異miRNAs聚類分析A.在VSMC中，通過qRT-PCR驗(yàn)證siMRAK048635_P1的干擾效率；B. 散點(diǎn)圖顯示NC組和siRNA組存在表達(dá)差異的miRNAs；C. 整體層次聚類圖，以log10 (TPM+1)值進(jìn)行聚類，紅色表示高表達(dá)miRNAs，藍(lán)色表示低表達(dá)miRNAs

2．靶基因預(yù)測(cè)及GO分析：利用miRanda、PITA和RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)的差異表達(dá)的miRNAs的靶基因共5066個(gè)。筆者對(duì)每組差異表達(dá)miRNAs的靶基因的集合分別進(jìn)行GO富集分析(圖2)。橫坐標(biāo)為GO 3個(gè)大類的下一層級(jí)的GO term，縱坐標(biāo)為注釋到該term下的候選靶基因個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋上的候選靶基因總數(shù)的比例。3種不同分類表示Go term的3種基本分類,從左往右依次為生物學(xué)過程、細(xì)胞成分、分子功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中302個(gè)基因具有GO分子功能注釋信息，其功能主要富集于血管內(nèi)皮遷移的負(fù)調(diào)控、心血管系統(tǒng)發(fā)育、信號(hào)受體活性、核染色質(zhì)和蛋白結(jié)合以及免疫應(yīng)答等。在查詢GO富集結(jié)果中與VSMC相關(guān)的基因時(shí)，有一個(gè)基因G protein-coupled estrogen receptor 1 (Gper1)多次出現(xiàn)。Gper1正是差異表達(dá)的miR-122-5p的靶基因。

圖2 候選靶基因GO富集柱狀圖

3.KEGG通路分析：利用KEGG對(duì)差異表達(dá)miRNAs靶基因集合中的基因進(jìn)行生物通路富集分析。這些靶基因顯著富集于軸突導(dǎo)向(n=8)、晝夜節(jié)律 (n=4)、N-糖基生物合成 (n=5)、內(nèi)吞蛋白加工 (n=9)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)礦物吸收 (n=7)、鞘脂代謝 (n=3)、核糖體生物合成 (n=3)、真核生物單純性皰疹病毒感染 (n=5)、萜類 (n=4)、骨架生物合成 (n=7)、腎素-血管緊張素系統(tǒng) (n=2)、維生素消化吸收 (n=2)、神經(jīng)活性 (n=2)、配體-受體相互作用 (n=8)、炎性介質(zhì)調(diào)節(jié) (n=4)、咖啡因代謝 (n=1)、糖酵解及糖異生 (n=3)、果糖及甘露糖代謝(n=2)、脂肪消化吸收 (n=2)及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(n=3)等相關(guān)通路 (P<0.05，圖3)。

圖3 候選靶基因KEGG富集散點(diǎn)圖

4.下調(diào)的MRAK048635_P1可能通過促進(jìn)miR-122-5p來(lái)調(diào)控Gper1的表達(dá): 筆者通過一系列體外實(shí)驗(yàn)繼續(xù)驗(yàn)證了生物信息學(xué)的分析結(jié)果。在MRAK048635_P1表達(dá)下調(diào)的大鼠VSMC中，miR-122-5p的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而Gper1 mRNA的表達(dá)被下調(diào) (P<0.01)。另外，與NC inhibitor組比較，miR-122-5p inhibitor組中的Gper1 mRNA的表達(dá)水平顯著增強(qiáng) (P<0.01，圖4)。

圖4 MRAK048635_P1通過抑制miR-122-5p來(lái)調(diào)控Gper1的表達(dá) A．轉(zhuǎn)染Scr siRNA和siMRAK048635_P1的VSMC中MRAK048635_P1、miR-122-5p和Gper1的表達(dá)；B．轉(zhuǎn)染miR-122-5p inhibitor和miR-122-5p inhibitor negative(NC)的VSMC中miR-122-5p和Gper1的表達(dá);C．MRAK048635_P1/miR-122-5p/Gper1 mRNA軸對(duì)高血壓疾病潛在的調(diào)控機(jī)制

討 論

血管損傷、血管重塑和血管生成是導(dǎo)致高血壓并發(fā)癥的主要原因[17]。lncRNAs和miRNAs參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC功能的調(diào)控。相關(guān)研究提示MRAK048635_P1可能在大鼠自發(fā)性高血壓中參與對(duì)VSMC功能的調(diào)節(jié)，因此對(duì)MRAK048635_P1進(jìn)行靶miRNAs預(yù)測(cè)及其生物學(xué)特性分析具有重要意義[18]。

聚類分析用于判斷差異miRNAs在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)模式,將表達(dá)模式相同或相近的miRNAs聚集成類,進(jìn)而識(shí)別未知miRNAs的功能或已知miRNAs的未知功能,這些同類miRNAs可能具有相似的功能[19]。本研究通過特異性siRNA下調(diào)大鼠VSMC中MRAK048635_P1的表達(dá)，通過整體層次聚類分析發(fā)現(xiàn)MRAK048635_P1下調(diào)后共13個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中5個(gè)miRNAs的表達(dá)被上調(diào)，7個(gè)表達(dá)被下調(diào)。成熟的miRNAs與其不完全互補(bǔ)的mRNA的3′UTR結(jié)合，在翻譯水平上抑制靶mRNA的表達(dá)。另外，miRNAs也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。接下來(lái)，筆者利用miRanda、PITA和RNAhybrid軟件來(lái)預(yù)測(cè)這些差異表達(dá)的miRNAs的靶基因[20]。

GO和KEGG分析被用來(lái)研究MRAK048635_P1表達(dá)下調(diào)后差異表達(dá)的miRNAs的靶基因的作用機(jī)制。GO是基因功能國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x出靶基因后，研究候選靶基因在GO中的分布狀況將闡明實(shí)驗(yàn)中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。筆者發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNAs的靶基因主要富集于血管內(nèi)皮遷移的負(fù)調(diào)控、心血管系統(tǒng)發(fā)育、信號(hào)受體活性、核染色質(zhì)和蛋白結(jié)合以及免疫應(yīng)答等生物學(xué)功能中。值得注意的是，GO富集結(jié)果顯示，miR-122-5p的靶基因Gper1尚參與調(diào)節(jié)血管平滑肌的分化。Gper1定位于染色體7p22上，由一條含7次跨膜結(jié)構(gòu)的肽鏈構(gòu)成，其主要組成包括配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、G蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)Asp-Arg-Tyr三聯(lián)體保守序列[21]。Gper1廣泛表達(dá)于心臟和動(dòng)靜脈的VSMC和內(nèi)皮細(xì)胞中，參與對(duì)血管中內(nèi)源性的血管收縮物質(zhì) (如血管緊張素Ⅱ)和血管擴(kuò)張物質(zhì)如NO的調(diào)節(jié)作用[22]。相關(guān)的機(jī)制研究顯示，作為7次跨膜受體，結(jié)合外源信號(hào)后的GPER可變構(gòu)激活表皮生長(zhǎng)因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)，進(jìn)而激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶 (PI3K)，然后，磷脂酰肌醇3磷酸 (PIP3)在細(xì)胞膜上聚集并通過其PH結(jié)構(gòu)域激活蛋白激酶B (PKB)，最終催化NO的合成。NO進(jìn)入VSMC并激活鳥苷酸環(huán)化酶 (GC)，GC通過cGMP-PKG通路介導(dǎo)血管松弛[23]。

臨床研究表明，由于Gper1參與了雌激素對(duì)血壓的調(diào)節(jié)，絕經(jīng)前女性的高血壓發(fā)生率明顯低于同齡男性。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，Gper1可能抑制VSMC中Ca2+通道的開放，降低胞內(nèi)Ca2+的濃度，從而抑制Ca2+-CaM復(fù)合物的形成，最終導(dǎo)致非內(nèi)皮依賴性的血管舒張[24]。結(jié)合本課題的研究結(jié)果，筆者推斷，在VSMC細(xì)胞中，MRAK048635_P1可能通過與miR-122-5p相互作用靶向Gper1，從而參與高血壓疾病的發(fā)生。與預(yù)測(cè)結(jié)果相同，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步揭示了一條MRAK048635_P1調(diào)控高血壓疾病發(fā)生、發(fā)展的潛在分子通路，即MRAK048635_P1/miR-122-5/Gper1 mRNA軸 (圖4)。當(dāng)然，要揭示其中的具體機(jī)制仍需要大量的工作，這將是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

本研究對(duì)差異表達(dá)miRNAs的靶基因進(jìn)行KEGG富集。在生物體內(nèi)，不同基因通過相互協(xié)調(diào)發(fā)揮其生物學(xué)功能，通過通路顯著性富集能確定候選靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。KEGG可對(duì)miRNAs諸多靶基因所涉及信號(hào)通路進(jìn)行整合分析。通路顯著性富集分析以KEGG通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景比較，在候選靶基因中顯著性富集的通路[25]。本研究中的KEGG通路分析結(jié)果顯示，MRAK048635_P1表達(dá)下調(diào)后差異表達(dá)的miRNAs功能顯著富集于軸突導(dǎo)向、晝夜節(jié)律、N-糖基生物合成、內(nèi)吞蛋白加工、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)礦物吸收、鞘脂代謝和核糖體生物合成等相關(guān)通路 (P<0.05)。KEGG結(jié)果提示MRAK048635_P1不僅在高血壓疾病中起著重要作用，而且可能參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)對(duì)VSMC中MRAK048635_P1下調(diào)后差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、GO分析和KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示MRAK048635_P1可能通過調(diào)控多種miRNAs參與信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。另外，MRAK048635_P1/miR-122-5/Gper1 mRNA軸可能在高血壓疾病中發(fā)揮著重要的作用，是一個(gè)頗有研究?jī)r(jià)值的生物學(xué)靶標(biāo)。